11第十二章基因的遗传和表达生物化学辩析.ppt

四、聚合酶链反应合成目的基因 设计扩增该基因的特异性引物 注意扩增产物要测序分析，防止PCR的错配导致目的基因的改变。 使用高保真Taq酶 尽量减少扩增循环圈数（25圈以内） 构建差示文库筛选特殊基因 反映不同组织细胞或同一种细胞在不同状态下，基因表达的差异的文库。 也称扣除文库 肝癌与正常肝脏mRNA表达的不同 肝癌细胞 正常肝细胞 提取mRNA 提取mRNA 逆转录cDNA单链 变性、复性 过滤分离去除双链 得到特定基因cDNA单链 3重组DNA技术的意义 填平了生物种属间不可逾越的鸿沟。 缩短了生物进化的时间 使人们能够对生物进行定向改造 重组DNA技术与医学、药学的关系 1、生物制药 2、基因诊断 3、基因治疗 4、疾病相关基因的研究 5、遗传病的预防 重要的工具酶-----内切酶 1 限制性内切酶 定义：是一类能够识别和切割双链DNA分子中特定碱基顺序的核酸水解酶。 命名：第1字母（大写）产生该酶细菌的属名的第一字母；第2、3字母（小写）细菌的种名；第4字母（大写）细菌菌株名；最后是罗马数字，代表该菌株中发现的第几个酶。 EcoRI，EcoRV BamHI，HinFI 2 功能 严格识别切割顺序，识别点多为回文结构，识别长度4-8bp，以6bp最常见。 切口2种 （1）平末端 5‘GGCC 3’ 5’GG CC 3’ 3‘CCGG 5’ 5’CC GG 5’ （2）粘末端 5‘GGATCC 3’ 5’G GATCC 3’ 3’CCTAGG 5’ 3’CCTAG G 5’ 异源同工酶（同裂酶）不同来源的内切酶，但有相同的识别位点，其切割位点可以一样或不同。 同尾酶：识别序列相关，切割后粘性末端相同。 远距离裂解酶：识别位点与切割位点不一致。 识别位点 切割位点 可变酶：识别位点中个别碱基可以变化，要求不特定。 SinI GG（A/T）CC CC（T/A）GG 3 DNA的甲基化作用 细菌体内存在限制和修饰系统（R-M） 对自身的DNA甲基化修饰，免受内切酶降解。 对外来的DNA通过限制性内切酶降解。 应用： 应用甲基化处理保护免受限制性内切酶降解 如：PstI和甲基化PstI的切割点相同，但切割的对象不同，结果不同。 4 内切酶的使用注意事项 用途 DNA重组克隆及亚克隆 DNA杂交与序列分析 改建质粒 构件基因组DNA物理图谱和文库 使用注意 保存-20~-80℃冰箱 酶量不超过反应体系的10% 两个酶同时切割时注意反应缓冲液条件，差距大时，分步酶切，步间要纯化。 DNA聚合酶 1 大肠杆菌DNA聚合酶I及其大片段（Klenow片段） 35KD 76KD 枯草蛋白酶水解 Klenow片段 大肠杆菌DNA聚合酶I的酶活性 5‘-3’DNA聚合酶活性 3‘-5’外切酶活性 5‘-3’外切酶活性 Klenow片段的酶活性 5‘-3’DNA聚合酶活性 3‘-5’外切酶活性 主要用途 催化DNA切口平移反应，准备高比活DNA探针 对DNA进行末端标记（仅限于Klenow） 2 Taq酶 是一类耐热的DNA聚合酶。 5‘-3’聚合酶活性 具有5‘-3‘外切酶活性 多数Taq酶缺乏3‘-5’外切酶活性，但进行荧光定量PCR时，所用Taq酶具备3‘-5’外切酶活性 3 反转录酶（逆转录酶） 催化以RNA为模板的DNA聚合反应 以mRNA为模板，催化合成出互补的DNA，称为cDNA 具有5‘-3’的聚合酶活性 缺乏3‘-5’外切酶活性，故它无校对功能，错配率较高。 mRNA DNA 逆转录过程 常见的逆转录酶 AMV 禽病毒来源 反应温度42 ℃ 用量2-8单位/反应 MMLV 鼠来源病毒 反应温度38 ℃ 用量100-300单位/反应 4 末端脱氧核糖核酸转移酶 活性：催化dNTP加到3‘羟基末端 用途：制造人工粘端 进行末端标记 DNA连接酶 作用：将两段DNA连接起来 种类：T4/T4（噬菌体来源）连接酶 大肠杆菌DNA连接酶 注意：连接DNA片段是否粘端 ATP活性 PEG和BSA合理添加 反应温度和时间 碱性磷酸酶 作用：去除5‘磷酸基团，防止自身连接。 种类：BAP细菌性碱性磷酸酶 CIP小牛肠碱性磷酸酶 用途：基因克隆中防止自身连接 某些5‘端标记前除取5‘磷酸基团 目的基因获得