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Chapter 5 High Performance Liquid Chromatography Objectives: 1. Grasp the characters and the application field of HPLC; 2. Grasp the theory of various separation modes and their suitable analytical objectives, and learn how to select the separation mode. 3. Grasp the principle, the advantage and disadvantage, and the application field of the detectors.了 4. Know the theory of capillary electrophoresis. 5. Know the development of HPLC 液相色谱仪（2） 液相色谱仪（3） 1.1 高效液相色谱与经典液相色谱方法的比较 高压: 一般可达到150?350×105Pa。 高速：HPLC采用高压输液设备，流速大增加，分析速度极快，只需数分钟；而经典方法靠重力加料，完成一次分析需时数小时；一般流动相流速为1?10 mL/min。 高效：填充物颗粒极细且规则，固定相涂渍均匀、传质阻力小，因而柱效很高。可以在数分钟内完成数百种物质的分离。 一般 n 30,000 plates/m。 高灵敏度:１～１０μL，足以完成全分析。 1.2 Comparation between HPLC and GC 分析对象及范围：GC分析只限气体和低沸点的稳定化合物，这些物质只占有机物总数的15-20%；HPLC可分析高沸点、高分子量的稳定或不稳定化合物，这类物质占有机物总数的80-85%。 流动相的选择：GC采用的流动相中为有限的几种“惰性”气体，只起运载作用，对组分作用小。 HPLC采用的流动相为液体或各种液体的混合，可供选择的机会多。它除了起运载作用外，还可与组分作用，并与固定相对组分的作用产生竞争，即流动相对分离的贡献很大，可通过溶剂来控制和改进分离。 操作温度：GC需高温；HPLC通常在室温下进行。 §2 Instrument 2.1 Mobile phase degassing 溶剂通过脱气器中的脱气膜，相对分子量小的气体透过膜从溶剂中除去（气泡会影响检测）。 ①吹氦气脱气法 　 ②加热回流法 　③抽真空脱气法 　④超声波脱气法 　 以上方法均为离线脱气，随溶剂存放时间延长又会有空气进入溶剂。 ⑤在线真空脱气法 将真空脱气装置串接到贮液罐与高压泵之间，实现溶剂在进入高压泵之前的连续脱气。脱气效果最优。 2.2 Mobile phase storage 贮液器 1-2L的玻璃瓶，配有溶剂过滤器(inlet filters Ni合金)，其孔径约2 ?m，可防止颗粒物进入泵内。 注：贮液罐放置位置要高于泵体，以保持一定的输液静压。 2.3 Mobile phase mixing梯度淋洗装置 gradient elution 外梯度: 利用两台高压输液泵，将 两种不同极性的溶剂按一定的 比例送入梯度混合室，混合后 进入色谱柱。 内梯度: 一台高压泵, 通过比例调 节阀，将两种或多种不同极性 的溶剂按一定的比例抽入高压 泵中混合。 低压梯度 用单泵产生梯度，泵前混合 脱气要求高 不易调节梯度的滞后体积 梯度洗脱的可变参数： 梯度的陡度和变化形状 纵坐标:B% 横坐标:时间 Improvement in separation efficiency by gradient elution Column: 1m x 2.1mm id, precision-bore stainless; packing: 1% PermaphaseR ODS. Sample: 5mL of chlorinated benzenes in isopropanol. Detector: UV photometer (254 nm). Conditions: temperature 60oC, Pressure: 1200 psi. 2.4 HPLC pump P807 15～35 MPa 为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（10μm），液体的流动相高速通过时，将产生