口腔教学论文口腔黏膜真菌鉴定方法的比较.docVIP

口腔教学论文：口腔黏膜真菌鉴定方法的比较 摘要：　比较常见用于黏膜真菌菌种鉴别的多种方法,探寻最佳的鉴别方法。采集230例普通人群口腔黏膜样本,分别用玉米吐温-80培养观察厚膜孢子法、糖发酵生化反应法、CHROMagar假丝酵母菌显色培养基法、ITS基因的PCR-RFLP(聚合酶链反应-限制性片段长度多态性)法、ITS测序菌种鉴定法,鉴别真菌各菌株。结果显示:有56例菌株至少通过1种方法检出真菌;玉米吐温-80分离培养假丝酵母菌37株; 50例菌株ITS基因测序共鉴定出8个菌种,白假丝酵母菌(C.albicans)29株,近平滑假丝酵母菌(C. parapsilosis)10株,热带假丝酵母菌(C. tropicalis)5株,Candida metapsilosis1株,Lodderomyces elongisporus1株,克柔假丝酵母菌(Candidakrusei)1株,乙醇假丝酵母菌(C. ethanolica)1株,季也蒙毕赤酵母菌(Pichia guilliermondii)2株; CHROMagar假丝酵母菌显色培养基法鉴定出3种菌株,分别是白假丝酵母菌、热带假丝酵母菌、近平滑假丝酵母菌; PCR-RFLP法检出5种菌株,分别是白假丝酵母菌、热带假丝酵母菌、近平滑假丝酵母菌、季也蒙毕赤酵母菌、克柔假丝酵母菌,与基因的测序鉴定一致率为91%;糖发酵生化反应法阳性标本占被检出真菌例数的46. 4% (26/56)。结果表明: ITS基因的测序法可以准确鉴定真菌各个菌种; PCR-RFLP法能鉴定常见的菌种,但操作繁琐;CHROMagar假丝酵母菌显色培养基法能快速准确鉴别3种常见假丝酵母菌菌种;玉米吐温-80可以准确培养鉴别白假丝酵母菌;糖发酵生化反应法,缺乏足够的敏感度和特异性,难以准确鉴别各个菌种。 关键词　：真菌;内转录间隔区(ITS);CHROMagar显色培养基;鉴定方法　　真菌在自然界中广泛分布,既是人体正常菌群成员也是重要的条件致病菌,常在机体免疫力下降时造成机会性感染。有资料显示,近年来临床分离的假丝酵母菌的感染率有增长趋势[1],而在医院临床感染的致病菌中,白假丝酵母菌感染已跃居第4位[2]。明确感染菌种、正确鉴定与分类,对及时诊治、预防感染具有十分重要的意义。常规的病原学诊断主要通过观察真菌的外部形态特征及一些生化特性来对其进行鉴定,近年来分子诊断技术逐渐应用于真菌种属的鉴别[3]。本实验运用多种不同的方法检测正常健康人口腔黏膜真菌带菌情况,分析各种方法的优缺点,探寻最佳真菌菌种鉴别方法。 1　材料与方法 1.1　材料 1. 1. 1　标本来源　 2008年1月至8月间230名辽宁中医药大学职业技术学院教职工和学生(所有研究对象均知情同意,自愿参加本项研究)。近3个月内未使用抗生素、糖皮质激素等免疫抑制剂,无肿瘤、糖尿病等导致免疫低下的系统性疾病。 1.1. 2　标准菌株　 白假丝酵母菌ATCC10231、近平滑假丝酵母菌ATCC2019、热带假丝酵母菌ATCC750由温州康泰生物科技有限公司提供,作为各种鉴定方法的对照菌株。 1. 1. 3　主要试剂和仪器 　①试剂: CHROMagar假丝酵母菌显色培养基(郑州博赛生物技术股份有限公司),糖发酵生化管(杭州天和微生物试剂有限公司),细胞溶解酶(Sigma, US),蛋白酶K(Merk, Germany), Tris、EDTA、SDS(Sigma, US),三磷酸脱氧核糖核苷( Roche, Switzerland),Taq酶(TaKaRa,大连宝生物工程有限公司), genefind-er核酸染料(Bio-V,厦门百维信生物科技有限公司),DNA分子量标准为DL2000 Marker(大连宝生物工程有限公司),MspI酶(TaKaRa,大连宝生物工程有限公司),真菌ITS1-ITS4通用引物[4](上海生工生物工程技术服务有限公司);②仪器:OlympusDP 71图像采集系统(Tokyo, Japan),Image Pro Plus 4. 5 software (Media CyberneticsInc., SilverSpring, MD, USA) DYY-8B型稳压稳流电泳仪(北京六一仪器厂),蓝盾TM551可见光凝胶电泳-透射仪(Bio-V,厦门百维信生物科技有限公司), 80-1离心机(上海手术器械厂)。 1.2　方法 1. 2. 1　真菌样本采集　 用无菌牙签采集后牙邻间隙牙菌斑样本于Ep管中, -20℃保存。同时检查记录受检者年龄、性别、学历、吸烟、饮酒习惯、口腔健康状况。 1. 2. 2　真菌分离培养 牙菌斑样本加入200μL生理盐水吹打混匀,吸取20μL菌液接种于沙保罗琼脂平板, 37℃培养24 h。用无菌牙签收集菌落于Ep