固体发酵纳豆激酶培养基的优化.docVIP

固体发酵纳豆激酶培养基的优化 摘 要: 研究蔗糖、葡萄糖、谷氨酸钠 3 种培养基对固体发酵纳豆激酶的影响, 发现添加蔗糖和谷氨酸钠能提高 纳豆激酶酶活, 而添加葡萄糖反而抑制酶活。优化后的培养基为: 4%蔗糖、0%葡萄糖、2%谷氨酸钠。 关键词: 纳豆激酶; 固体发酵; 蔗糖; 葡萄糖; 谷氨酸钠 纳豆激酶(nattokinase)是一种枯草杆菌蛋白激 酶, 是在纳豆发酵过程中由纳豆枯草杆菌产生的一 种丝氨酸蛋白酶, 1987 年由日本的须见洋行等首先 发现并命名的, 它是纳豆菌在发酵大豆时向胞外分 泌的一种易溶于水的碱性蛋白酶 [1] 。 近年来专家对纳豆激酶的结构、酶的活性部位 以及酶学性质的研究比较多, 纳豆激酶是由 275 个 氨基酸残基组成的一条单链多肽, 准确分子量为 27728, 等电点为 8.6±0.3, 敏感作用底物是纤维蛋 白。酶学性质研究表明纳豆激酶在 pH 6~12, 50 ℃ 以下均较稳定 [2] 。 由于纳豆激酶是由纳豆菌发酵得到的, 可以大 规模生产, 而且在日本已经有上千年食用的历史, 所 以纳豆激酶是一种安全的理想的预防和治疗栓塞的 生化药物。 目前研究的纳豆激酶包括液体深层发酵和固体 发酵两种来源。有关液体发酵培养基优化方面的研 究已经很多, 本文主要研究在固体发酵条件下, 添加 蔗糖、葡萄糖和谷氨酸钠对纳豆产酶的影响。 1 材料 纳豆菌: 从日本纳豆中分离纯化所得, 实验室保 藏; 平板分离培养基: 酵母粉: 2%, 麦芽糖 0.5%, 氯 化钠 0.5%, 琼脂粉 2%, 121 ℃灭菌 20 min; 试管斜 面培养基: 肉汤固体培养基; 液体种子培养基: 酵母 粉: 2%, 麦芽糖 0.5%, 氯化钠 0.5% , 121 ℃灭菌 20 min。琼脂糖、纤维蛋白原、凝血酶、尿激酶标准品, 中 国药品生物制品检定所; 蔗糖、葡萄糖、谷氨酸钠均为市售。 2 方法 2.1 种子培养 从斜面接一杯种子到 50 mL 液体培养基中, 37 ℃摇床 150 r/min 培养 16 h。 2.2 固体发酵工艺 [3] 精选优质东北大豆洗净, 直径在 5.7~6.3 mm 之 间, 浸泡 10 h, 按要求添加各种浓度的培养基, 121℃ 高压灭菌 30 min, 自然冷却到 70 ℃左右, 4%接种量 接上液体种子, 置生化培养箱中 37 ℃培养 24 h, 待 用。 2.3 纤维蛋白平板法测纳豆激酶活性 [4,5] 用 PBS (pH 7.4) 溶液将标准尿激酶配制成 5、 10、15、20、25 IU/mL 5 个浓度梯度, 将这 5 个浓度的 尿激酶溶液用微量进样器注入平板孔内, 10 !L/孔, 37 ℃培养 18 h, 游标卡尺测量每个溶圈的垂直直 径, 计算溶圈面积, 以尿激酶活力单位数为横坐标, 溶圈面积为纵坐标, 绘制标准曲线。根据提取的纳豆 激酶溶圈面积的大小, 在标准曲线上找出相当于尿 激酶的活力单位数。 2.4 从新鲜纳豆中提取纳豆激酶 在每瓶新鲜发酵的纳豆中, 加入 200 mL 生理 盐水浸取 1 h, 然后 3 000 r/min 离心 10 min, 取上清 液, 稀释一定的倍数, 采用 2.3 方法测定酶活。 3 结果 3.1 尿激酶标准曲线 尿激酶浓度和对应溶圈面积见表 1、图 1。 表 1 尿激酶浓度和对应溶圈面积 尿激酶浓度/(IU·mL -1 ) 5 10 15 20 25 溶圈面积/mm 2 116 153 174 199 225 从图 1 可以看出, 尿激酶活力与溶圈面积基本 上成直线关系, 其直线方程为: y = 5.28x + 94.2, 用 此方程可以计算出纳豆激酶的纤溶活性。 收稿日期: 2007- 11- 20 作者简介: 李永飞(1976- ),女,工程师, 专业方向: 生物和食品工程。 582008 年第33 卷第1 期粮 食 加 工 图 1 尿激酶活力与溶圈面积的关系 3.2 蔗糖对纳豆激酶的影响 称取浸泡后的湿豆子 8 瓶, 每瓶 100 g, 分别加 入 1%葡萄糖和 0.5%谷氨酸钠, 分成 4 组, 分别加入 质量分数为 0%、2%、4%、6%的蔗糖, 把培养基摇匀 后, 置 121℃灭菌 30 min, 冷却至 70 ℃左右, 接入 4%液体种子, 摇匀, 置 37 ℃培养箱培养 24 h 。 采用 2.3、2.4 的方法浸取纳豆激酶并测定其酶 活, 分别取平均值。见图 2。 图 2 蔗糖对纳豆酶活的影响 从图 2 可以看出, 在低浓度下, 随着加入的蔗糖 质量分数越高, 纳豆激酶酶活越高, 蔗糖有利于促进 纳豆产酶, 添加 4%与 6%纳豆产酶一样, 最终确定 蔗糖的添加量为 4%。 3.3 葡萄糖对纳豆激酶的影响