第五章-分子生物学方法(下)试卷.ppt

6.5 利用酵母鉴定靶基因的功能 6.5.1 酵母的遗传学和分子生物学简介 6.5.2 酵母基因转化与形状互补 6.5.3 外援基因在酵母中的功能鉴定 6.5 利用酵母鉴定靶基因的功能 6.5.1 酵母的遗传学和分子生物学简介 具有和动植物细胞相似的结构特征和细胞生长 发育过程； 很多基因在酵母和动植物细胞中高度保守； 容易进行生物化学与分子生物学操作； 具有快速生长、无性繁殖、简便的平板影印能力； 酵母是最早完成基因组DNA全序列测定的单细胞 真核生物，有稳定的单倍体和二倍体细胞； 酵母单倍体和二倍体细胞在形态上有相似性，但 存在重大差异： ①二倍体细胞的直径大约是单倍体的1.3倍； ②二倍体细胞呈长形或卵圆形，单倍体接近圆形； ③二倍体细胞和单倍体细胞的出芽方式不同。 6.5 利用酵母鉴定靶基因的功能 6.5.2 酵母基因转化与形状互补 利用整合型质粒可以对酵母基因组中的任意 基因进行精确的敲除（置换），并通过孢子 繁殖中的四分体分析技术进行观测和研究。 基因置换一般在二倍体中进行； 基因置换方法有两种： 一步置换法 二步置换法 6.5 利用酵母鉴定靶基因的功能 6.5.3 外援基因在酵母中的功能鉴定 将外源基因克隆于酵母表达载体上，转化 野生型或突变酵母菌株，通过观察酵母的 表型变化或分析细胞中化学成分的变化， 推测该基因的生物学功能。 因为酵母细胞中有与动植物细胞比较接近 的蛋白质转录后修饰系统，许多在大肠杆 菌中不产生功能蛋白质的动植物基因在酵 母中表达后往往具有生物学功能。 6.5 利用酵母鉴定靶基因的功能 6.6.1 凝胶滞缓实验 6.6.2 噬菌体展示技术 6.6.3 蛋白质磷酸化分析技术 6.6 其他分子生物学技术 6.6 其他分子生物学技术 凝胶滞缓试验（gel retardation assay），又叫作DNA迁移率变动试验（electrophoretic mobility shift assay，EMSA），是用于体外研究DNA与蛋白质相互作用的一种特殊的凝胶电泳技术。 在凝胶电泳中，由于电场的作用，裸露的DNA 朝正电极移动的距离与其分子量的对数成反比。如果此时DNA分子与某种蛋白质相结合，那么，由于分子量增大，它在凝胶中的迁移作用便会受到阻滞，在特定电压和时间内朝正电极移动的距离也就相应缩短了。 6.6.1 凝胶滞缓实验 6.6 其他分子生物学技术 拟南芥转录因子与不同 DNA元件有不同的结合能力。 6.6 其他分子生物学技术 噬菌体是细菌病毒的总称，英文为 Bacteriophage，来源于希腊文“phagos”， 有“吞噬”之意。 噬菌体可被分为溶菌周期和溶源周期两种不同的类型。在溶菌周期，噬菌体将其感染的宿主细胞转变成为噬菌体的“制造厂”，产生出大量的子代噬菌体颗粒。实验室常将只具有溶菌生长周期的噬菌体叫作烈性噬菌体。 溶源生长周期是指噬菌体DNA被整合到宿主细胞染色体DNA上，成为它的一个组成部分，感染过程中不产生子代噬菌体颗粒。具有这种溶源周期的噬菌体被称为温和噬菌体。 6.6.2 噬菌体展示技术 6.6 其他分子生物学技术 将编码“诱饵”蛋白的DNA片段插入噬菌体基因组，并使之与噬菌体外壳蛋白编码基因相融合。重组噬菌体侵染宿主细菌后，复制形成大量带有杂合外壳蛋白的噬菌体颗粒，直接用于捕获靶蛋白库中与 “诱饵”相互作用的蛋白质。 噬菌体展示技术的基本原理： 6.6 其他分子生物学技术 噬菌体展示技术研究蛋白质的相互作用 “诱饵” 由于细胞内可能有多达上千个蛋白激酶，体内检测某个蛋白激酶活性非常困难，科学家常用体外激酶活性分析法来检测蛋白激酶活性。 该方法能十分可靠地鉴定某个蛋白激酶对底物的磷酸化作用，筛查激酶的特异性底物。 6.6.3 蛋白质磷酸化分析技术 底物蛋白磷酸化：双向电泳、质谱分析 蛋白激酶活性检测：体外激酶活性分析法 6.6 其他分子生物学技术 蛋白激酶体外磷酸化活性分析 6.6 其他分子生物学技术 * * * 80年代末以来发展起来的一种新型分子生物学技术，是通过一定的途径使特定的基因失活或缺失的技术。通常意义上的基因敲除主要是应用DNA同源重组原理，用同源片段替代靶基因片段，从而达到基因敲除的目的。随着基因敲除技术的发展，新的原理和技术也逐渐被应用，比较成功的有基因的插入突变和iRNA，它们同样可