工业淀粉酶的纯化与分析试验报告.doc

工业淀粉酶的纯化与分析 实验目的 掌握盐析法纯化分离蛋白质的工作原理和方法 掌握利用葡萄糖凝胶层析法进行蛋白质脱盐的技术 掌握测定淀粉酶活力的基本原理和方法 学习Folin-酚比色法测定蛋白质含量的原理和方法 实验原理 工业淀粉酶含有大量杂质将其溶解浸提后离心，利用高浓度的硫酸铵溶液将上清液的蛋白质沉降下来，所得沉淀溶解后即为盐析液。 利用葡糖糖凝胶G-25对大分子量蛋白质和小分子盐类的阻滞作用不同，从而经凝胶层析使盐析液中的蛋白质和盐类分离。 酶活力是以酶在最适条件下，催化一定化学反应的初速度来表示的。在本实验中，是以一定量的淀粉酶在37摄氏度，PH=6.8的条件下，每分钟水解淀粉酶生成1mg还原糖的量为一个酶活力单位，其中还原糖的量用DNS法测定。 蛋白质在Folin-酚试剂的作用下生成钨蓝和钼蓝，测定其在500nm波长下的吸光度 ，从而求得样品中蛋白质的含量。 实验材料及仪器设备 材料：工业淀粉酶 仪器：电子天平；离心机；UV9100型分光光度计 恒温水域；沸水浴 器材：刻度试管：25ml*21；移液管：1ml*6、5ml*1；烧杯：250ml*2、50ml*1; 研钵：一套；移液枪：一套；离心管：100ml*1;1.5ml*4;7ml*1;注射器：1ml*1； 层析装置：1套；量筒：100ml*1；洗耳球：2个；胶头滴管：2个；移液管架； 玻璃棒 实验试剂 BaCl2 溶液（1%） 考马斯亮蓝G-250 1%NaCl溶液 淀粉溶液（0.5%） 磷酸缓冲液（0.2molr/L,pH 6.8） NaOH溶液（2.5mol/L） 牛血清蛋白（BSA）标准液（250ug/ml） Folin-酚试剂甲 Folin-酚试剂乙 葡萄糖标准液（1mg/ml） DNS试剂 实验步骤 浸提 称取0.317g淀粉酶制剂，经浸提离心后转移上清液1.2ml于离心管中，标记为“粗酶液”备用。记录剩余体积为18.2ml并转移到50ml烧杯里，置于冰浴中。 2．盐析 按70%的饱和浓度称取6.976g(NH4)2SO4固体，研细后，缓缓加入离心后的酶液中。待(NH4)2SO4固体溶解后，冰浴静置20min后离心，将离心后固体溶解于4ml蒸馏水中，并分装于3支1.5ml离心管中，标记“盐析”备用。 3．脱盐 用洗脱液洗脱柱子，经检验没有残留的盐和蛋白质后,对蛋白质进行脱盐。用注射器注射0.5ml盐析液，上样完毕后，打开出水口，进行洗脱，并收集洗脱液，每管2ml。分别用BaCl2和考马斯亮蓝G-250试剂检验试管中洗脱液的成分。把含有蛋白质的收集液合并于离心管中，标记“脱盐”备用。 4．酶活力测定 粗酶液 0.05ml 加蒸馏水 稀释至25ml，摇匀待用 盐析液0.05ml 加蒸馏水 稀释至25ml，摇匀待用 脱盐液0.2ml 加蒸馏水 稀释至10ml，摇匀待用 空白 标准葡萄糖浓度梯度 粗酶液 盐析液 脱盐液 0 1 2 3 4 5 A0 A1 B0 B1 C0 C1 葡糖糖液(ml) 0.0 0.22 0.4 0.6 0.8 0.9 　 　 　 　 　 　 淀粉酶液(ml) 　 　 　 　 　 　 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 H2O(ml) 3.2 3.0 2.8 2.6 2.4 2.3 　 　 　 　 　 　 pH6.8缓冲液 　 　 　 　 　 　 1 1 1 1 1 1 NaOH溶液(ml) 　 　 　 　 　 　 1 1 1 预热 摇匀，37℃水浴，5min 预热的淀粉酶 　 各1ml迅速摇匀 酶促反应 37℃水浴，5min NaOH溶液(ml) 　 　 　 　 　 　 1 1 1 DNS试剂 各2ml迅速摇匀 显色反应 沸水浴5min，冷却定容至25ml，摇匀 比色 以0号管为空白参比，测定λ=540nm处的吸光度 记录吸光度 0.000 0.025 0.098 0.191 0.276 0.28 0.172 0.295 0.145 0.493 0.216 0.396 还原糖（mg） 0.000 0.200 0.400 0.600 0.800 0.900 0.5092 0.9633 0.7408