庆大霉素产生菌低温保存的研究.docVIP

庆大霉素产生菌低温保存的研究 南阳普康 李静仁 一、前言 菌种是从事微生物学研究的基本材料，也是发酵工业关键的工序。如何有效地长期保存重要的工业生产菌种，并使其保持纯种及代谢产物活性，这是工业微生物领域中十分关注的问题。长期以来，人们均采用传统的砂土保存法和冷冻干燥保存法，这些方法虽能保存菌种，但在保存过程中会有不同程度的变异、退化等现象。从目前情况看，保存菌种的最好途径是采用低温（-80°C）保存，该方法适用范围广，能防止变异，对长期保存各类菌种非常有利。本研究庆大霉素产生菌放线菌为研究对象，根据低温生物学的有关理论，对菌种低温保存中的各个环节进行了试验，得出了一套使用方便，可靠的保存方法。 二、国内外低温保存菌种的现状 1968年，Mazw.P.和Schmidt,J.J.曾对啤酒酵母菌进行了较全面的低温保存研究；；°C（或-60°C）这段温度范围。影响生物材料低温保存效果的主要因素有（1）降温程序和速率；（2）复温的程序和速率；（3）采用的抗冻剂种类和浓度；（4）抗冻剂加入和取走的方式。 我们根据上述论点，并借鉴国外学者低温保存各类菌种的方法，对庆大霉素产生菌的低温保存做了较全面、细致的研究，并获得了令人满意的结果。 三、材料和方法 在本实验中，采用直径为0.3mm的铜--康铜热电偶实测了在降温、复温过程中样品的实际温度；并用微机控制的低温生物降温仪来控制样品的降温速率。本研究所使用的抗冻剂有：10%甘油、10%DMSO（二甲亚砜）、脱脂牛奶和生理盐水。 实验步骤如下：以抗冻剂作为菌种孢子的分散剂，配制成浓度为106个/ml的孢子悬浮液；×8cm的玻璃安瓿为冷冻试管，在试管内加入0.3ml孢子悬浮液；试管被密封后放入低温生物降温仪的冷腔内，按预定的降温程序和速率降温，并同时用自动温度记录仪测出样品在降温过程中温度随时间变化的特性曲线；当样品温度降至-80°C时，将试管由降温仪中取出，直接移入液氮容器中贮藏。在复温时将样品从液氮容器中取出，放入27°C～35°C的水浴中，轻轻摇动试管，直到结晶体完全融化。最后，对经低温保存的菌种进行培养并测定存活率；对未经低温处理的孢子悬浮液也同时进行培养并测定存活率，以资比较。孢子存活率被定义为： 低温保存后孢子的存活率＝ 经低温保存后存活孢子浓度×100。 未经低温保存的孢子浓度 四、结果与讨论 降温速率、复温速率与存活率 由低温生物学理论可知，在一般情况下，生物材料低温保存的存活率，与其降温、复温速率有关；°C/分～450°C/分的范围内都能获得90％以上的存活率。尽管降温速率越大，细胞产生胞内冰的可能性也越大，但是快速冷却对细胞的致命作用是在于复温过程中胞内冰可能产生的再结晶理象。我们认为只要在冰晶融化之前,使复温速率大到足以能防止再结晶的产生，那么快速降温产生的胞内冰是无害的。 抗冻剂对存活率的影响 选用合适的抗冻剂，这在一般生物材料的低温保存中是一个很重要的环节。在庆大霉素产生菌种的低温保存中，我们采用了不同的抗冻剂作为孢子的悬浮液，然后在相同的降温、复温条件下观察其存活和生长情况，结果表明，几种抗冻剂用于庆大霉素产生菌的低温保存，均能得到80％以上的存活率。在一般生物材料低温保存中，DMSO是很常用的抗冻剂，但有文献报道，认为它不适合作为保存菌种的抗冻剂材料，因其对菌种有害。但在我们的试验中，用DMSO作为抗冻剂保存的菌种，有很高的存活率，并且其菌落生长形态和生长速度也正常。 菌种低温保存前后的生长形态比较 在-196°C低温下能够长期保存菌种的原理是低温能大大减低菌种的代谢速度，而在低温下菌种的形态、生理生化特性的潜在能力仍保持不变，所以经过复温和培养，菌种原有的一切特征均可恢复。我们将低温保存后复温的菌种与未经低温处理的菌种进行了对照培养，从生长速度、菌落形态、密度来看，两者几乎无差异。 为了进一步观察低温处理后的菌种孢子形态有无变化，我们作了电子显微镜观察比较。观察到的孢子形状，低温处理后的孢子形态完整，与对照组相比无可见差异。 低温保存菌种对生产水平的影响 　　由于在抗生素药物的生产过程中，菌种的生产水平（即每毫升培养液中含有的抗生素国际单位：u/ml）是一项很重要的指标，因此我们对低温保存后菌种行了测定，并与传统的砂土保存法进行比较。测定方法如下： (1)、用同一出发菌株，经自然分离后，挑选一至二支斜面孢子，对每一支斜面孢子，一半以砂土方法保存，另一半以低温方法保存，然后测定各自的生产水平。 (2)、用同一出发菌株，自然分离后挑选十支斜面孢子，其中五支以砂土方法保存，另五支以低温方法保存，然后分别测出每支斜面孢子的生产水平，并与原种的生产水平比较，得出相对效价： 相对效价＝保存后菌种的生产水平×100％ 　　　　　原种的生产水平 由实验数据可见，经低温保存的菌