06实验六SDSPAGE测定蛋白质的分.pptVIP

实验六 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 测定蛋白质分子量 一、实验目的 学习SDS测定蛋白质分子量的原理 掌握垂直板电泳的操作方法 二、实验原理 SDS中蛋白质与SDS分子按比例结合（1：1.4W/W) ，形成SDS-蛋白质复合物，消除了各种蛋白质分子之间的电荷差异 蛋白质分子的迁移速度只取决于分子大小。分子量在15KD到200KD之间时，logMW=K-bm 连续系统：电泳体系中缓冲液pH值及 凝胶浓度相同，电荷和分子筛效应。 PAGE 不连续系统: 缓冲液离子成分、pH、 凝胶浓度及电位梯度的不连续性。 电荷效应、分子筛效应、浓缩效应。 三、实验试剂 2?样品缓冲液 10?电极缓冲液母液（pH8.3） 染色液 脱色液 四、实验步骤 五、实验结果分析 绘制标准曲线：log MW = K - bm  蛋白质区带中心至分离胶上沿距离 相对迁移率= 溴酚蓝至分离胶上沿距离 以每个蛋白标准的分子量对数作纵坐标，相对迁移率作横坐标，作标准曲线，然后在计算出待测蛋白的迁移率即可在标准曲线上查出其分子量。 六、思考题 在SDS中，当分离胶加完后，在其上加一层乙醇的目的是什么? 在SDS中分离胶与浓缩胶中均含有TEMED和AP, 试述其作用? 解释浓缩效应和分子筛效应。 * * 浓缩效应 凝胶孔径的不连续性（2种孔径的凝胶） 缓冲液离子成分及pH值的不连续性（2种缓冲体系，3种pH）：浓缩胶，pH6.8，蛋白质分子的迁移率比Cl- 低，比Gly高。 电位梯度不连续性：快离子（ Cl- ）后面形成高电位梯度区，慢离子（Gly）前面形成低电位梯度区，高电位梯度和低电位梯度之间的地方，形成一个稳定而不断向阳极移动的界面，蛋白质分子在界面处浓缩成一个狭小的中间层。 低分子量标准蛋白： 兔磷酸化酶B MW=97400  牛血清白蛋白 MW=66200 兔肌动蛋白 MW=43000 牛碳酸酐酶 MW=31000 胰蛋白酶抑制剂 MW=20100 鸡蛋清溶菌酶 MW=14400 (1) 30%丙烯酰胺（Acr） （2）10%SDS （3）1.0mol/L pH8.8 Tris-HCl缓冲液 （4）1.0mol/LpH6.8Tris-HCl缓冲液 （5）10%过硫酸铵(AP)（现配现用）   （6）TEMED（四甲基乙二胺） 1.将玻璃板洗净晾干, 准备2个干净的烧杯  2.把玻璃板在灌胶支架上固定好3.配好分离胶（15ml）,用小烧杯连续平稳加入，至凹槽高度的大约7/10处，之后加0.5cm高水，静置30分钟※凝胶配制过程中，TEMED要在注胶前再加入，否则凝结后无法注胶 12%的分离胶（15ml） 30%丙稀酰胺 6.3ml 1M Tris-HCl(pH8.8) 5.6ml H2O 3.1ml 10%SDS 150ul 10%AP 100ul TEMED 20ul ※水封的目的是为了使分离胶上沿平直，并排 除气泡。 ※凝胶聚合好的标志是胶与水层之间形成清晰 的界面。4.倒出水并用滤纸吸干，配好浓缩胶（10ml），加入浓缩胶，迅速插入样梳，静置约30分钟。 ※样梳需一次平稳插入。梳口处不得有气泡， 梳底需水平。 5.0%的浓缩胶（10ml） 30%丙稀酰胺 1.7ml 1M Tris-HCl(pH6.8) 1.3ml H2O 7.0ml