SHP2酪氨酸磷酸酶CSH2结构域的表达纯化和NMR研究.docVIP

浙江理工大学学报, 第 26 卷, 第 4 期,2009 年 7 月 Journal of Zhejiang Sci-Tech University Vol .26 , N o .4, Jul .2009 文章编号:1673-3851 (2009)04-0602-06 SHP-2 酪氨酸磷酸酶 C-SH2 结构域的表达纯化和 NMR 研究 李少飞, 郭江峰, 丁先锋 (浙江理工大学生命科学院, 杭州 310018) 　　摘 要:SH P-2 是一种非跨膜型蛋白酪氨酸磷酸酶 。 将其 N 末端结构域 C-SH2 克隆至原核表达载体 pG EX-2T 中, 命名为 pG EX-2T-C-SH2 。 该融合蛋白在大肠杆菌中以可溶形式表达于菌体上清液中, 经 G ST 亲和层析柱和 FP LC 分子筛柱纯化后, 目的蛋白纯度可达 98%。 质谱分析表明, 目的蛋白相对分子量与理论值基本相同。 在最适 表达条件下, 1 L 的 M 9 培养基能够高效表达并获得 12 mg C-SH 2 蛋白, NM R 结构和活性位点的分析表明, 目的蛋 白能正确折叠并呈规则的空间结构。 关键词:SH P-2 ;C-SH2 ;蛋白纯化;同位素标记;NM R ;H SQC 中图分类号:Q 78 文献标识码:A 0 引 言 SH P-2 属于蛋白酪氨酸磷酸酶家族成员之一 ,作为细胞因子 、生长因子及其它胞外刺激因素的下游信号分 子,表达于机体的各种组织和细胞中,与细胞增殖、分化、转移、死亡等重要的生命活动密切相关[ 1-3] 。SH P-2 是 由PTPN11 基因所编码的 ,其 N 末端前后含有两个SH 2 结构域 N-SH 2(3 —104)和 C-SH 2(112 —216),C 末 端含有一个具有催化活性的 PTP 结构域(221 —524)及富含脯氨酸基团和酪氨酸磷酸化位点的末端[ 4] 。 H of 等[ 4] 用 X-射线研究了 SH P-2 结构(1 —527),但仍有部分肽段结构尚未解析出来 ,包括 156 —160 、 236 —245 、295 —301 和 313 —323 。Ugochukw u 等[ 5] 同样用 X-射线研究了易受影响的 SH P-2 结构(237 — 529),295 —301 结构解析出来,但是 236 —245 和 313 —323 结构还是受影响 。X-射线不容易测定一些松动 结构区域的三维结构 ,但是用 NM R 可以在较短的时间内把易受影响的结构区域解析出来[ 6-7] 。以前研究重 点是 N-SH 2 ,近年来发现 C-SH 2 可能发挥重要作用。 C-SH 2 在自身未磷酸化的情况下 ,可能募集SH P-2 到细胞表面受体[ 4 , 8] 。C-SH 2 可能通过 C 末端的 66 个氨基酸来调控 PT P 结构域。C-SH 2 可能募集 SH P-2 聚集在磷酸化配体周围, 增大 N-SH 2 与磷酸化配体 的结合机会,使蛋白构象变化并激活该酶[ 9] 。C-SH 2 增强了信号转导过程的专一性和特异性[ 9-10] 。 大量的研究表明 ,SH P-2 中 C-SH 2 结构域突变后 ,磷酸化酪氨酸残基 pY 不能与其结合, 从而不能暴露 出 PTP 结构域的活性催化位点, 抑制该酶活性并阻碍信号转导级联反应 ,但对于其生物学作用及多种致病 机制仍需作更深入了解。SH 2 突变与 Noonan 综合征[ 11-12] , 急性白血病[ 13-14] ,胃癌[ 15-16] ,肺腺瘤,黑素瘤等疾 病的关系还不明确, 使其难以应用于临床诊断和治疗。因此, 对 SH2 的结构和功能的研究具有重要意义。 本研究将 C-S H2 目的基因插入到 pGEX-2T 表达载体, 表达出 GST 融合蛋白 ,通过 GS T 亲和层析柱纯化 后,用 NM R 对 C-S H2 蛋白进行初步结构分析 ,为进一步研究其结构和功能奠定基础。 收稿日期:2009 -01 -07 作者简介:李少飞(1983 - ), 男, 山东烟台人, 硕士研究生, 主要从事分子生物学研究。 第 4 期 李少飞等:SH P-2 酪氨酸磷酸酶 C-SH 2 结构域的表达纯化和 N M R 研究 603 　材料和方法 .1 材 料 S HP-2 全基因序列质粒和15 N H4 Cl 由美国休斯顿大学高晓莲教授提供 , 原核表达载体 pGEX-2T 及宿 主菌 E .coli BL21(DE3)为本实验室提供 ,限制性内切酶 EcoR I 和 B amH I(New England Biolabs 产品), PCR 产物纯化试剂盒(A x