00生物化学实验--常用生物化学实验技术及原理-比色分析技术.doc

比色分析技术 　　分光光度法是利用单色器（主要是棱镜）获得单色光来测定物质对光吸收能力的方法。物质对不同波长的光波具有选择吸收的特性，分光光度法就是基于物质的这种特性而建立起来的分析方法，它是光谱分析技术中最基本和最常用的方法，因其具有灵敏、准确、快速、简便、选择性好等特点而被广泛应用。 一、比色分析的基本原理 　　比色分析技术是利用物质对光的吸收作用来对物质进行定性或定量分析的技术。分光光度法是光谱分析技术中最常用的一种，应用最多的是紫外 - 可见光分光光度法。 （一）吸光度与透光度 　　当一束光线通过均匀、透明的溶液时可出现三种情况：一部分光被散射，一部分光被吸收，另有一部分光透过溶液。设入射光强度为 I 0 ，透射光强度为 I ， I 和 I 0 的比值称为透光度（ transmittance ， T ），即 T ＝ ，其数值小于 1 。 T 与 100 的乘积称为百分透光度，以 %T 表示。透光度的负对数称为吸光度 (absorbance ， A) 。其表达式为： 　A ＝－ LgT ＝－ Lg ＝ Lg （二） Lambert-Beer 定律 　　Lambert-Beer 定律指出当一束单色的辐射能通过介质或溶液后，有一部分被吸收，其辐射能的吸收与溶液中吸收物质的浓度和溶液厚度的乘积成正比。 Lambert-Beer 定律适用于可见光、紫外光、红外光和均匀非散射的液体。 Lambert-Beer 定律是描述溶液吸光度同溶液浓度和溶液液层厚度之间关系的基本定律，该定律是分光分析的理论基础。 　　其表达式为： 　A ＝ KLC 　式中， A —— 吸光度； 　K —— 吸光系数； 　L —— 溶液厚度，称为光径； 　C —— 溶液浓度。 　　根据 Lambert-Beer 定律，当液层厚度单位为 cm ，浓度单位为 mol/L 时，吸光系数 K 称为摩尔吸光系数（ ε ）。 ε 的意义是：当液层厚度为 l cm ，物质浓度为 l mol/L 时，在特定波长下的吸光度值。 ε 是物质的特征性常数。在一定条件（入射光波长、温度等）下，特定物质的 ε 不变，这是分光光度法对物质进行定性的基础。通过对某物质已知浓度的溶液测定其吸光度，可求得该物质的 ε ，其表达式为： 　ε ＝ 　式中， ε —— 摩尔吸光系数； 　A —— 吸光度； 　L —— 溶液厚度； 　C —— 溶液浓度。 二、影响比色分析的因素 　　按照 Lambert-Beer 定律，某一种物质在相同条件下，其浓度和吸光度成正比，应用 Lambert-Beer 定律产生误差主要来源于光学、化学和溶液浓度三方面的因素。 　（一）光学因素 　　Lambert-Beer 定律要求入射光是单色光，目前在多数分光条件下，所分出的单色光并不是严格的单色光，而是包括一定波长范围宽度的谱带，其它波长的杂色光是引起误差的主要原因。入射光的谱带越宽，其误差越大。 　　入射光的选择对 Lambert-Beer 定律也有影响，在工作中总是选取吸光物质最大波长为入射光，这不仅可取得最大的灵敏度，而且吸光物质的吸收光谱在此处有一个较小的平坦区， ε 值变动很小 , 因此能得到较好的线形关系。 　（二）化学因素 　　溶液对光的吸收程度决定于吸光质点的性质和数目，如果溶液中的化学反应使吸光质点发生了变化，必然会引起吸光度的改变。浓度、 pH 、溶剂和温度等因素均可影响化学平衡，使被测物质的浓度因解离、缔合及形成新的化合物而发生变化，从而使吸光度和浓度不成线性关系。 　（三）溶液浓度 　　Lambert-Beer 定律是一个有很大局限性的定律，只适用于稀溶液（浓度 10 -4 ～ 10 -2 mol/L ）。因为在高浓度时，吸光粒子间的平均距离小了，以致每个粒子都会影响其邻近粒子的电荷分布。这种相互作用，就使它们的摩尔吸光系数（ ε ）发生改变，因而导致偏离 Lambert-Beer 定律。因此在实际工作中，待测溶液的浓度最好控制在 0.01M 以下。 三、比色分析的分类 　　光谱分析指利用物质具有吸收、发射或散射光谱谱系的特点，对物质进行定性或定量的分析方法。它具有灵敏、快速、简便等特点，是生物化学分析中最常用的分析技术。 　　光谱分析技术可分为发射光谱、吸收光谱和散射光谱三大类。基于发射光谱分析的方法有火焰光度法、原子发射光谱法和荧光光谱法，基于吸收光谱分析的方法有紫外 - 可见光分光光度法，原子吸收分光光度法和红外光谱法；基于散射光谱分析的方法有比浊法等。本文仅介绍常用的吸收光谱分析的方法 “ 紫外 - 可见光分光光度法 ” 和 “ 原子吸收分光光度法 ” 。 　（一）紫外 - 可见光分光光度法 　　紫外和可见吸收光度分析法是