DNA_ladder_protocol细胞凋亡操作步骤.doc

前言:由于实验室经费问题(我想很多实验室都有这个问题,毕竟很多时候我们没有老外足够的经费),我决定利用DNA LADDER来证明(当然还辅助其它的方法)经过药物处理的细胞发生了凋亡还是坏死,所以一直研究DNA LADDER方法,自己曾经看了文献中的很多方法,自己也尝试了一下,发现还是最经典的是最好的!在整个实验过程得到了wscoco78等战友的大力帮助和建议(下面方案中有一些是wscoco78的原话,表示感谢!),并最终成功了,回顾这一段经历,感觉对自己的科研态度和科研方法都很有启发,整理了一下资料,希望与大家共享!也希望大家能够把自己好的成功方法也贴上来,大家一起努力,相信没有做不好的实验!如果大家有什么这方面的问题,可以发信至:biochujun@126.com,我会解答大家的问题的! 也希望大家批评指正! 注:黑色字体部分为细胞实验指南P108~109的内容(完全一样),其中红色部分为我的改动以及一些建议,希望您能成功! 三、DNA裂解分析 凋亡的标准特征之一，是基因组DNA断裂为180-200bp的多条寡核小体片段。此现象可用常规琼脂糖凝胶电泳检测，是凋亡的特征。由于该技术只能提供细胞死亡的定性分析，一般要结合定量的方法以确定样品的凋亡程度。另有需注意的重要之处，一些细胞类型或细胞系(如K562，10T1/2，Raji)在凋亡时不是以此种方式断裂DNA，另外在坏死细胞中也不发生这样的DNA裂解。这不是凋亡细胞的限定性试验，但不论在何系统中，这都是确定细胞死亡有用的特性。 DNA裂解测量有几种方法，包括FACS分析和完整的标记DNA的检测。另一种方法TUNEL，需DNA末端标记，用于单个细胞DNA裂解的测定。凋亡常常伴随有DNA的裂解，这些技术在凋亡测量中都有意义。 (一)琼脂糖凝胶电泳 1)将5×105细胞移人无菌的1.5-ml Eppendorf管中，4℃ 2000 r／min离心5分钟，弃上清。 注意不要使用过多的细胞，否则随后的酶解可能不完全，形成很黏稠的DNA溶液。 储军注:①细胞接种数:我一般是将细胞按照5×105细胞/35mm平皿接种,然后培养两天(因为接种后的细胞 有部分会死亡,所以培养一天的细胞可能会少,个人觉得培养两天比较合适,细胞不要太多了!!!!),然 后再加药物处理,处理时间看您药物的类型和剂量,不过建议您做几个梯度,同时进行,这样可以看出 剂量和时间对细胞凋亡的影响程度,我当时做的是每隔8h,测量一次,太累,建议您每隔12h或者24h 测量一次 ②离心速度:我是4℃ 2000 r／min离心5分钟,按照我实验室离心机换算RCF(相对离心力)为367g ③细胞收集: 贴壁细胞需要把漂浮细胞和贴壁细胞（胰酶消化）一起收集，离心，然后用预冷的 PBS再洗涤一次,注意丢弃上清液要小心,注意不要把细胞吸走了,我一般使用1ml和0.1ml两个移 液枪来操作的,1ml取走大部分上清夜,0.1ml把剩余的小心取走! 2)加入20μl溶解缓冲液[20 mmol/L EDTA，100 mmoll/L Tris，pH8.0，0.8％(w/v) SDS] 。用移液管尖混匀细胞沉淀。 小心：SDS(见附录5) 不要形成强的旋涡，因为高分子量DNA可能被剪切。 储军注: ①加入溶解缓冲液前:虽然上清液被丢弃,但是一般在管底还是有少量上清液,此时可以用食指轻 弹管底,使得细胞沉淀尽可能融解,为加入溶解缓冲液后混匀创造条件。 ②溶解缓冲液的配制: 把EDTA,Tris-base,SDS放在一起搅拌混匀，使用pH计测得其pH值大概 在8.0左右，根本不需要加HCL调pH值!只要你的试剂好（fluka、amresco、sigma），照 这些经典方法基本上都不需要调pH值，真的很准，上下0.5而已。 ③混匀细胞沉淀:有了①,这步应该可以很好做了, 把枪尖浸入液面下，部分按下按钮(很重要,否 则溶液里有很多气泡,导致溶解缓冲液没有充分混匀啊!)，只是形成暗流，在液面下涌动，气体 不放出来自然无气泡! 3)加10μl RNA酶A/T1混合液(分别为500U/ml，20000U／ml，Ambion Inc．)，轻弹管尖混匀，不要形成旋涡。37℃孵育30-120分钟。 储军注: ①混匀:方法同2