微生物工程实验指导.doc

实验一 微生物学实验基本技能训练 一、目的要求 1．学习配制基本培养基。 2．了解并学习高压蒸汽灭菌的基本原理及操作。 3.学习无菌操作技能 二 一、器皿的准备 在配制培养基的过程中，首先要使用一些玻璃器皿，如三角瓶、试管、培养皿、烧杯、吸管等，这些器皿在使用前都要根据不同的情况，经过一定的处理，洗刷干净，进行包装、灭菌后，才能使用。 1. 玻璃器皿的清洗 （1） 新玻璃器皿? 新玻璃器皿含有游离碱，一般先将其浸于 2% 的盐酸溶液中数小时，然后用自来水清洗干净。也可将器皿先用热水浸泡，再用去污粉或肥皂粉刷洗，最后经过热水洗刷、自来水清洗，待干燥后，灭菌备用。 （2） 用过的玻璃器皿 试管或三角瓶的洗刷：盛有废弃物的试管或三角瓶，因其内含大量微生物，洗刷前应先经过高压蒸汽灭菌。对只带有细菌标本或培养物的试管等玻璃器皿，用过后应立即将其浸于 2% 的来苏尔消毒水中，经 24h后，才可以取出洗刷。用蜡封口的试管或石油发酵用瓶，清洗前先将其置于高压蒸汽灭菌器中消毒，然后取出，趁热拔去沾有蜡或油的棉花塞，立即倒去培养污物，再将试管投入温水中，稍加洗刷后浸于 5% 的肥皂水内，煮沸5min，以去除试管上的油污。也可将倒空的瓶子用汽油浸泡，待油溶解后再刷洗。加过消泡剂的发酵瓶或做过通气培养的大三角瓶，一般先将倒空的瓶子用碱粉或用 10% 的火碱水去掉油污后，再行洗刷。管壁或瓶壁上留有培养物的痕迹，用试管刷难以去除，此时可用一根粗铁丝把顶端弯曲，捆几层纱布，浸湿，沾一点去污粉，或再沾少许细沙，擦磨管壁或瓶壁，就可把器壁的痕迹擦掉。 培养皿的清洗：用过的器皿中往往有废弃的培养基，需先经高压蒸汽灭菌或沸水煮沸 30min 后，倒掉污物，方可清洗。如果灭菌条件不便，可将皿中培养基刮出来，倒在一起，以便统一处理。洗刷时，先用热水洗一遍，再用洗衣粉或去污粉擦洗，然后用自来水冲洗干净，将平皿全部向下，一个压着一个，扣于洗涤架上或桌子上。 吸管的清洗：吸过菌液的吸管，用完后应放入装有 5% 石炭酸溶液的高玻璃筒内消毒；未吸过菌液的吸管，用后放入清水中，防止干燥；吸过带油液体的吸管，应先在 10% 的氢氧化钠溶液中浸泡半小时，去掉油污，方可清洗。如果吸管经以上处理仍留有污垢，可再置于洗液中浸泡 1h，再进行清洗。吸管上端的隔离棉花，可用普通钢针制成的小钩钩出，清洗时，将直径为 6 ～7.5mm的橡皮管一端连在自来水龙头上，另一端套在吸管的底端，放水冲洗即可。洗净的试管顶端向下，下面垫一块干净的厚布或几层纱布，使吸管的水分能迅速被吸干。 附：洗液配制方法 浓洗液配方：重铬酸钾40g，浓硫酸 800mL，水 160mL。 稀洗液配方：重铬酸钾50g，浓硫酸 100mL，水 850mL。 配制方法：将重铬酸钾溶于水中，冷却后，边搅拌边将浓硫酸缓缓加入溶液中。 2.?器皿的包扎 （1） 试管和三角瓶? 灭菌之前，试管口和瓶口均需先塞好棉花塞，棉花不可塞得过紧，亦不得过松，和管壁和瓶壁紧贴的曲面不可出现裂纹。待棉塞做好之后，在塞棉塞的瓶口外面包一层牛皮纸，用线绳扎好；试管应 10 个一捆，也用牛皮纸和线绳扎好，置于烘箱中灭菌备用。 （2） 培养皿? 洗净的平皿通常用报纸包装，每包 10 ～ 12 套，或将平皿每 10 套放入一个待制的铁皮圆形平皿筒中，加盖，置烘箱中，灭菌备用。 （3） 吸管? 包扎前吸管的粗头应先塞少许普通棉花，以避免应用时因不慎而将菌液吸入口中，或将口内物吹入培养液中。塞入的棉花应与吸管口保持5mm左右的距离，若距离太近，容易被唾液浸湿，造成通气不良。一般这段棉花全长不得短于10mm。塞好棉花的吸管要进行包装。将报纸裁为宽为 5 ～8cm的长纸条，先把试管的尖端放在纸条的一端，呈 45°角折叠纸条，包住尖端，一手捏住管身，一手将试管压紧在桌面上，向前滚动，以螺旋式包扎，最后将剩余的纸条打结，灭菌备用。 二、培养基的制备 培养基的制备过程可简单描述为：配料—溶解—校正 pH—加凝固剂—融化—过滤—分装—加棉塞、包扎—灭菌—无菌检查。 （1） 溶解配料? 制备培养基时，先在烧杯中放入所需水量的一半，按培养基配方称取各项材料，依次加入水中，逐个溶解，最后加足水量。在加料过程中，各种成分溶解的次序应该是先加缓冲化合物，然后是主要元素、微量元素，最后加维生素等。 （2） 调 pH? 配料溶解完后，并冷却到室温时，用精密 pH 试纸或酸度计测试溶液的 pH，然后根据要求的 pH 确定需加酸或加碱。当加入酸或碱液时，要缓慢、少量、多加搅拌，防止局部过碱或过酸而破坏营养成分。常用 10% NaOH 或 6mol/LHCl调整 pH。 （3） 加凝固剂? 配制固体培养基时，需加入凝固剂 （如琼脂、明胶等），若以琼脂为凝固剂时，一般先将琼脂加入煮沸的液