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浙江理工大学学报,第26卷,第4期,2009年7月Journal of Zhejiang Sci-Tech UniversityVol.26, No.4, Jul. 2009文章编号: 1673- 3851(2009)04- 0602- 06SHP-2酪氨酸磷酸酶C-SH2结构域的表达纯化和NMR研究李少飞,郭江峰,丁先锋(浙江理工大学生命科学院,杭州310018)摘　要: SHP-2是一种非跨膜型蛋白酪氨酸磷酸酶。将其N末端结构域C-SH2克隆至原核表达载体pGEX-2T中,命名为pGEX-2T-C-SH2。该融合蛋白在大肠杆菌中以可溶形式表达于菌体上清液中,经GST亲和层析柱和FPLC分子筛柱纯化后,目的蛋白纯度可达98%。质谱分析表明,目的蛋白相对分子量与理论值基本相同。在最适表达条件下,1 L的M9培养基能够高效表达并获得12 mg C-SH2蛋白,NMR结构和活性位点的分析表明,目的蛋白能正确折叠并呈规则的空间结构。关键词: SHP-2; C-SH2;蛋白纯化;同位素标记; NMR; HSQC中图分类号: Q78　　文献标识码: A引　言SHP-2属于蛋白酪氨酸磷酸酶家族成员之一,作为细胞因子、生长因子及其它胞外刺激因素的下游信号分子,表达于机体的各种组织和细胞中,与细胞增殖、分化、转移、死亡等重要的生命活动密切相关[1-3]。SHP-2是由PTPN11基因所编码的,其N末端前后含有两个SH2结构域N-SH2(3— 104)和C-SH2(112— 216),C末端含有一个具有催化活性的PTP结构域(221— 524)及富含脯氨酸基团和酪氨酸磷酸化位点的末端[4]。Hof等[4]用X-射线研究了SHP-2结构(1— 527),但仍有部分肽段结构尚未解析出来,包括156— 160、236— 245、295— 301和313— 323。Ugochukwu等[5]同样用X-射线研究了易受影响的SHP-2结构(237—529),295— 301结构解析出来,但是236— 245和313— 323结构还是受影响。X-射线不容易测定一些松动结构区域的三维结构,但是用NMR可以在较短的时间内把易受影响的结构区域解析出来[6-7]。以前研究重点是N-SH2,近年来发现C-SH2可能发挥重要作用。C-SH2在自身未磷酸化的情况下,可能募集SHP-2到细胞表面受体[4,8]。C-SH2可能通过C末端的66个氨基酸来调控PTP结构域。C-SH2可能募集SHP-2聚集在磷酸化配体周围,增大N-SH2与磷酸化配体的结合机会,使蛋白构象变化并激活该酶[9]。C-SH2增强了信号转导过程的专一性和特异性[9-10]。大量的研究表明,SHP-2中C-SH2结构域突变后,磷酸化酪氨酸残基pY不能与其结合,从而不能暴露出PTP结构域的活性催化位点,抑制该酶活性并阻碍信号转导级联反应,但对于其生物学作用及多种致病机制仍需作更深入了解。SH2突变与Noonan综合征[11-12],急性白血病[13-14],胃癌[15-16],肺腺瘤,黑素瘤等疾病的关系还不明确,使其难以应用于临床诊断和治疗。因此,对SH2的结构和功能的研究具有重要意义。本研究将C-SH2目的基因插入到pGEX-2T表达载体,表达出GST融合蛋白,通过GST亲和层析柱纯化后,用NMR对C-SH2蛋白进行初步结构分析,为进一步研究其结构和功能奠定基础。1　材料和方法材　料SHP-2全基因序列质粒和15NH4Cl由美国休斯顿大学高晓莲教授提供,原核表达载体pGEX-2T及宿主菌E. coli BL21(DE3)为本实验室提供,限制性内切酶EcoR I和BamH I(New England Biolabs产品),PCR产物纯化试剂盒(Axygen公司产品),蛋白定量试剂盒(江苏碧云天生物科技公司产品),GST亲和层析柱(GenScript产品),凝血酶(Sigma产品),Sephadex 75 HP填料(北京韦氏博慧色谱科技有限公司产品),其他常规试剂均为进口分装或国产分析纯。1.2　重组质粒pGEX-2T-C-SH2的构建1.2.1　引物设计根据SHP-2全长DNA序列(GenBank号:L03535),设计合成特异的上游引物和下游引物,扩增C-SH2基因,为方便克隆,上游引物的5端引入了BamH I酶切位点,下游引物的5端引入了EcoR I酶切位点,上游引物为5-AGCC GGATCCTGGTTTCATGGACATC-3,下游引物为5-AGCC GAATTCTAAGTTA-AGGGGCTGCTT-3。1.2.2　基因序列的扩增以SHP-2全基因序列质粒为模板,PCR扩增C-SH2基因。反应程序:95℃预变性5 min,95℃变性30 s,56℃退火30 s,72℃延伸30 s,进行30个循环,最