蛋白质及氨基酸的测定专用课件.pptVIP

⑷结果计算 式中 X----氨基酸态氮的含量，g/100g； c ----氢氧化钠标准溶液的浓度，mol/L； V1----用中性红作指示剂滴定时消耗氢氧化钠标准溶液体积，mL； V2----用百里酚酞作指示剂滴定时消耗氢氧化钠标准溶液体积，mL； m----测定用样品溶液相当于样品的质量，g； 0.014----氮的毫摩尔质量，g/mmoL。 电位滴定法 (1) 原理 根据氨基酸的两性作用，加入甲醛以固定氨基的碱性，使羧基显示出酸性，将酸度计的玻璃电极及甘汞电极同时插入被测液中构成电池，用氢氧化钠标准溶液滴定，依据酸度计指示的pH值判断和控制滴定终点。 (2) 试剂 ①酚酞乙醇指示液：1% ②硼砂（标准物质）缓冲液：PH9.22 称取3.8克Na2B4O7 溶解后，定容至1000mL ③中性甲醛溶液：２０% ④氢氧化钠标准溶液：0.0500mol/Ｌ (4) 试验步骤 ① 吸取含氨基酸约20mg的样品溶液，置于100mL容量瓶中，加水至刻度，混匀后吸取20.0mL置于200mL烧杯中，加水60mL，开动磁力搅拌器，用0.05mol/L氢氧化钠标准溶液滴定至酸度计指示pH8.2（记下消耗0.05mol/L氢氧化钠标准溶液的毫升数，可计算总酸含量）。 ② 加入10.0mL甲醛溶液，混匀。再用0.05mol/L氢氧化钠标准的溶液继续滴定至pH9.2，记下消耗0.05mol/L氢氧化钠标准溶液的毫升数。 ③ 同时取80mL蒸馏水置于另一200mL洁净烧杯中，先用0.05mol/L氢氧化钠溶液调节至pH为8.2，再加入10.0mL中性甲醛溶液，用0.05mol/L氢氧化钠标准溶液滴定至pH9.2，做试剂空白试验。 原理 氨基酸在碱性溶液中能与茚三铜作用，生成蓝紫色化合物。该蓝紫色化合物的深浅与氨基酸含量成正比，在波长570nm处有最大吸收峰，故据此可以测定样品中氨基酸含量 仪器 可见分光光度计 1、2%茚三铜溶液 2、pH为8.04磷酸缓冲液 3、氨基酸标准溶液 操作方法 标准曲线的绘制 准确吸取200ug/ml的氨基酸标准溶液0.0ml、0.5ml、1.0ml、1.5ml等，分别置于25ml比色管中，个加水至容积为4.0ml，然后加入2%茚三铜溶液和pH为8.04的磷酸盐 缓冲液各1ml，混合均匀后于水浴上加热15min，取出迅速冷至室温，定容，摇匀。静置15min后，在570nm波长下，以试剂空白为参比液测定各溶液的吸光度A値。以氨基酸的微克数为横坐标，吸光度A值为纵坐标，绘制标准曲线。 注意事项 茚三铜受阳光、空气、温度、湿度等影响而被氧化呈淡红色或深红色，使用前需进行纯化。 原理 挥发性盐基氮是指动物性食品由于受酶和细菌的作用，在腐败过程中因蛋白质分解而产生的胺类等含氮物质，挥发性盐基氮是评价肉及肉制品、水产品等新鲜度的重要卫生指标，挥发性盐基氮可采用半微量定氮法测定。挥发性盐基氮遇弱碱氧化镁即被游离而蒸馏出来，蒸馏出的氨被硼酸吸收后生成硼酸铵，是吸收液变为碱性，混合指示剂由紫色变为绿色。 试剂 1. 1%的氧化镁混悬液 2. 20%的硼酸指示剂 测定 1、样品处理 2、蒸馏吸收 3、滴定 结果计算 C------盐酸标准溶液的浓度，mol/l V1------滴定样品吸收液时消耗盐酸标准溶液体积。 M------样品质量，g V0------滴定空白吸收液时消耗盐酸标准溶液浓度，g/mmol 注意事项 1、滴定重点的观察，应注意空白试验与样品的测定色调一致。 2、每个样品测定之前要用蒸馏水洗涤仪器2-3次 谢谢 微量凯氏定氮法 1.原理：同常量凯式定量法 2.仪器：微量凯氏定氮法装置 3.试剂：a,b,c,d,e,f（同常量凯氏定氮法） g.0.01000mol/L盐酸标准溶液 4.测定：a.消化（步骤同常量法） b.蒸馏 c.滴定 蒸馏： 1、安置装置：将消化完全的消化液冷却后，全部移入100mL容量瓶中，定容，摇匀。按图装好装置 2、蒸馏：准确移取消化液10mL与试管内，经漏斗再加入10mL 400g/LNaOH溶液使呈碱性，用少量蒸馏水洗漏斗数次，夹好漏斗夹，进行水蒸气蒸馏。冷凝管下端预先插入盛有10mL 40g/L(或20g/L)硼酸吸收液的液面下。 3、蒸馏结束：蒸馏至吸收液中所加的混合指示剂变为绿色开始计时，继续蒸馏10min后将冷凝管尖端提离液面再蒸馏1min，用蒸馏水冲洗冷凝管尖端后停止蒸馏。 滴定： 流出液用0.01000mol/L盐酸标准溶液滴定至微红色为终