WB实战指南+正确使用Quantity One定量.docVIP

来dxy好多年了，这些年陆陆续续回复了一些帖子，可是回来回去，发现大家提的问题，还是那么几个，没有从根本上有所提高，确实出乎意料。看过很多总结经验的帖子，不知道该如何评价，要么抄书本，要么人云亦云，缺乏自己的东西，新手参考这些当然难获进益。实在受不了，这些混淆视听的东西，本人把这么多年的回复，略作整理完善拼凑成《WB实战指南》，欢迎行家批评指正。首先，摆摆自己的经验。鄙人做WB有8、9年了，平均下来两天跑一张多的蛋白胶；文章嘛，凑数的单篇有上24+，一作单篇15+（系国内完成；注：当年的IF，现在逐年递减没个标准）。其次，由于一些机缘的因素，在实验室WB体系完善的过程中，很多靠自己摸索；说实话，碰了一鼻子灰，差不多能碰到的问题都经历了，因此我敢写这样一个咚咚给大家分享。再次，我再强调一点，对我们这类人来说，实验结果的可靠、漂亮已经不算一个要求；如何缩短操作时间，使实验进行的更有效率也是我们所追求的，因此本文会针对两个普遍采用的却可以看成浪费时间的操作，Bradford法蛋白定量和立春红染膜做专门批判，这在以前的WB操作指南是绝无的，甚至叛离被视为经典的分子克隆。——可是，请记住，经典是人定的。话不多废，开始：样品制备：变性条件——SDS LB直接裂解：用常温或者高温预热过（预热更有利于阻止蛋白水解或者磷酸酶去磷酸化，但容易遗忘，LB久煮某些性质会改变）的1*SDS LB（或者略高1.5*）直接加到细胞或者组织上并煮样。通常6孔板细胞80%以上密度，需200ul，其他按平板面积比类推。通常条件下，SDS LB都是过量的（因此不一定要严格参考SDS LB稀释比）；如果SDS LB不够，样品核酸、蛋白浓度过高时，煮样后会发现tip吸不上来，非常粘、一砣一砣的，很容易堵住tip。这时候常规做法有两种，1. 再煮5min。常规煮样时间3-5min，样品过浓时就煮10min；2.如果10min煮样后，仍然吸不起来，才适当增加SDS LB，继续煮；也可以对样品进行超声。煮样时间若过长，蛋白会凝固，此时以失去继续WB的意义，请丢弃（判断标准：出现明显的蛋白沉淀和水分层）此方法的缺点，SDS LB煮过的样品如果用来做IP，需要特殊方法，因此，这种制备方法制备的样品有使用局限。非变性裂解法（不讨论诸如核抽提、亚细胞器分离等等了，其实类似）裂解细胞请尽量冰上操作，减缓酶解作用。俺前boss nature文章上的裂解液配方是：20mM Tris/HCl, pH7.6, 100mM NaCl, 20mM KCl, 1.5mM MgCl2, 0.5% NP-40 and protease inhibitors (20μg/ml leupeptin, 10μg/ml pepstatin A and 10 μg/ml aprotinin)（此裂解液可用于抽提核蛋白），其中蛋白酶抑制剂很复杂也很贵，其实用0.5mM PMSF替代这三种就好了；如果还要做磷酸化蛋白，加1mM Na3VO4（现加现用），10 mM NaF, 1 mM Na3VO4, 50 mM beta-GP。此方法的优点：NaCl浓度略低于生理状态，保证裂解细胞的方式较为温和，便于随后的IP等试验。其他Na盐浓度的细胞裂解液也很常见，诸如0.15M（生理盐浓度）、0.3M、0.6M（高盐系列，裂解细胞时染色体会析出，细胞碎片和沉淀非常粘稠）及0.8-1.2M；0.3M及以下适合IP试验，0.6M及以上适合纯化蛋白，尤其相互作用较强的复合体，要得到纯化的一些复合体的组成蛋白一般采用极端的高盐裂解细胞。用于核蛋白的裂解的原因是0.5% NP-40，用于破坏核膜结构；可用到1%，但此时染色体会析出，沉淀粘稠。组织块裂解：组织块较大用匀浆的方法最合适，现在有不少转头很小的匀浆器。当组织超微量的时候，比如50mg新鲜癌组织，我采用的方法是1. 低温（剪）搅碎，成肉糜状。2. 锡箔纸包裹好，放入少量液氮，快速敲击（控制力量，尽量避免弄破锡箔纸），进一步破碎；反复多次。3. 用上述细胞裂解液回收。分泌型蛋白富集：用无血清培养基培养细胞，收集上清液用于WB检测；如果含量过低，需要用TCA沉淀富集。理论上，从普通培养基中收集分泌蛋白，此时对细胞生长条件的影响最小，是最佳的实验条件；但是这存在隐忧。因为含血清的培养基中含有非常丰富的BSA（牛血清白蛋白）之类的蛋白质，除非你进一步分离纯化，否则直接用这种样品去WB会有非常大的麻烦，尤其当你的蛋白在60-46 kDa之间的时候；用“任何”抗体去检测这一区间的蛋白，会有一片非常强的信号。因为此区间蛋白（主要是BSA）浓度过于富集，会非特异性粘附“任意”抗体，从而最终被识别。同理，采用SDS LB裂解细胞制备样品前，通