经典一组织培养技术.pptVIP

组织培养技术 绪 论 一、基本概念 组织培养 tissue culture 从体内取出组织模拟体内生理环境，在无菌、适当温度和一定营养条件下，使之生存和生长并维持其结构和功能的方法。 使用组织块（O.5～1立方毫米）或薄片（厚0.2 毫米） 细胞培养 Cell Culture 方法同上，培养物是单个细胞或细胞群。 器官培养 Organ Culture 应用和组织培养相似的条件，培养的是器官的原基、器官的一部分或整个器官，使之在体外生存、生长和保持一定功能的方法。 使用器官原基或器官的一部分或整个器宫 体外培养 in vitro 细胞培养 Cell culture 组织培养 Tissue culture 器官培养 Organ culture 二、发展史 德国人Roux（1885）用温生理盐水体外培养鸡胚组织并存活数月被认为是组织培养的萌芽试验。 1903年Jolly用盖片悬滴培养法，培养蝾螈白细胞生活一月，提示组织或细胞离体后，在人工培养条件下，仍能生存。 1907年Harrison创建了盖片覆盖凹窝玻璃悬滴培养法，在无菌条件下，采用淋巴液作培养基，培养蛙胚神经组织生活了数周，并曾观察到神经细胞凸起的生长过程。由此建立了体外培养组织和细胞的基本模式系统。 1923年，Carrel设计了卡式瓶培养法，扩大了组织的生存空间。 1924年Maximow的双盖片培养法，使之更易于传代和减少污染。 1957年Dulbecco 等采用胰蛋白酶消化处理和应用液体培养基的方法，获得了的单层细胞培养，单层培养成了组织培养普遍应用的技术。促进了细胞系(cell line)的建立。 近年各种条件已商品化系列化，应用冷冻技术，各国建立细胞库 我国组织培养的发展 20世纪30年代传入我国。 20世纪50年代起步 20世纪70年代，成为医学和生物学研究中普遍应用的手段。 近20年，建立了人和各种动物肿瘤及其他细胞系，细胞培养库已初步建成，细胞培养用品，培养剂、学清、试剂等已商品化。 高科技的引入和开展，各种培养用具不断被引入，电镜技术、标记技术、单细胞显微注射、荧光免疫、电泳技术、杂交瘤技术、DNA转染核细胞转化、分子杂交等 实验操作者需要注意的问题 掌握操作技术，理解各种操作的基本原理 有判定细胞生长好坏和是否发生污染的能力 熟悉体外培养细胞的生存条件、细胞的生物学性状和相关的基本理论知识。 各种液体要专人配制，并保证做到按规程行事；制备浓度精确、灭菌可靠。所有制备好的溶液和试剂瓶上都要有标签，注上名称、浓度、消毒与否和制备日期。 一切培养用品都要有固定的存放地点（尤其培养用品与非培养用品应严格分开；以消毒与未消毒品应严格分开存放）， 目的：避免各种杂质混入细胞生存环境、防止微生物感染和细胞“污染”。 细胞污染：不同细胞之间因操作不严造成的相互混杂，使细胞群体部村的现象。 三、组织培养优缺点 优点： 能长时间直接观察活细胞的形态结构和生命活动 ；可用于细胞学、遗传学、免疫学、实验医学和肿瘤学等多种学科的研究工作 便于观察、记录、摄影 ，直接观察细胞变化 可供研究的细胞种类广泛，从低等生物到高等动物，以及人类；从胚胎到成体；从正常组织到肿瘤细胞，皆可 便于使用不同方法研究细胞（相差显微镜、荧光显微镜、电自显微镜、组织化学和同位素标记等） 易于施加物理、化学和生物因素进行实验 培养细胞携带有与体内细胞同等的基因组，也是分子生物学和基因工程学的研究对象和组成部分。 可同时提供大量生物性状相似的实验对象，耗资少，经济。 已成为生物制品、基因工程制品、单克隆抗体生产的必要手段 作为一种技术，有其局限性 组织和细胞离体以后，独立生存在人工培养环境中，与体内环境相比，仍有很大差异。故实验结果不能外推至体内，轻易做出与体内等同的结论。 组织培养基本理论知识 一、组织培养细胞生物学 体内外细胞的差异 当细胞被置于体外培养后，一旦失去神经体液的调节和细胞相互间的影响，生活在缺乏动态平衡的环境中，发生变化是必然的。 培养细胞最多见的表现是：失去原有组织结构和细胞形态、分化减弱或不显、出现类似“返祖现象”；表现为细胞趋向单一化，或获得不死性，或变成具有恶性性状的细胞群。 可能的机制：组成人体的细胞高度分化，细胞间呈现着高度的相互依存性、个体细胞相对失去独立性。从受精卵形成开始，细胞的两个基本过程增殖和分化，便协调地进行着。增殖使细胞数量增多，分化使机体结构和功能多样化，最终演变形成完整的人体。此间每个细胞的生命活动，均听命于外源信号，通过相关基因的调控，使之发生增殖或分化的表达。当细胞被立体培养后，信号来源切断，特定基因分化表达减弱或停止。而进化中保守的细胞增殖活动却可维持；遂使体内外细胞出现了差异