实验12PCR实验1.docVIP

幻灯片1 PCR技术 幻灯片2 一、聚合酶链式反应（PCR）概述 （一）概念 聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaciton, PCR)，即PCR技术，是近年来发展起来的一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法。 幻灯片3 （二）发展历程 1971年 Kjell Kleppe提出PCR原始雏形 概念 1983年 Kary Mullis发明PCR技术 1987年 获得专利 1993年 诺贝尔化学奖 幻灯片4 二、PCR反应的原理和步骤 PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。 PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成： 幻灯片5 DNA复制 幻灯片6 二、PCR反应的原理和步骤 PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。 PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成： 幻灯片7 1、模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备； 2、模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合； 幻灯片8 退火温度与退火时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度。引物的退火温度可通过以下公式帮助选择： Tm值(解链温度)=4(G+C)+2(A+T) 退火温度=Tm值-(5～10℃) 幻灯片9 3、引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链。 重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的片段富集106～109倍。所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。 幻灯片10 PCR的基本步骤 重复1~3步 25~30轮 目的DNA片段 扩增100万倍以上 DNA变性 形成2条单链 子链延伸 DNA加倍 DNA单链 与引物复性 DNA双螺旋 幻灯片11 四、PCR反应体系的主要成分和作用 DNA聚合酶 模板 引物 dNTP 缓冲体系 幻灯片12 （一）DNA聚合酶 Taq DNA聚合酶来源于嗜热水生菌，与一般的聚合酶所不同的是在高温状态仍具有活性。 可分为两大类： 1、具有校正功能的（有3’→5’核酸酶活性） 比如：Vent,pfu,pwo等 2、不具有校正功能的 （无3’→5’核酸酶活性） 比如：一般的Taq DNA聚合酶 幻灯片13 （二）模板 核酸模板的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一，传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K来消化处理标本。一般临床检测标本，可采用快速简便的方法溶解细胞，裂解病原体，消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离，直接用于PCR扩增。RNA模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止RNase降解RNA。 幻灯片14 （三）引物 引物是PCR特异性反应的关键，PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。 幻灯片15 设计引物应遵循以下原则： 1、引物长度一般15-30个bp，常用为20bp左右。引物过短过长都会使特异性降低。 2、引物扩增跨度以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。 3、引物碱基G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。 4、避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。 幻灯片16 5、引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处。 6、引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。引物量以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。 幻灯片17 （四）dNTP的质量与浓度 　 dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系。在PCR反应中，dNTP应为50～200umol/L，尤其是注意4种dNTP的浓度要相等(等摩尔配制)，如其中任何一种浓度不