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猪β-干扰素基因的定点突变 摘要： 本实验根据基因库中的猪β-干扰素基因，通过PCR法定点突变技术，构建原核高效表达系统并分析原核表达产物生物活性。 根据本实验的目的及要求，将第17位编码Cys的TGT突变为编码Ser的TCT，另外因为猪β-干扰素基因为真核生物基因，在原核细胞中表达时，由于密码子的偏好性不同，通过分析目的基因序列及相关密码子结构，对下列基因进行同义突变：第3位编码Tyr的 TAT 突变为TAC，第7位编码Arg的CGA突变为CGT，第164位编码Arg的CGG突变为CGT。 关键词： 猪IFN-β基因 基因定点突变 抽提 1.材料与方法： 1.1 实验材料 1． 酚、氯仿、异丙醇（分析纯） 2． 95%乙醇（分析纯） 3． 10xBuffer 4. 多功能DNA纯化回收试剂盒 5． Tris缓冲液(pH8.8) 称取Trisl2.1g，用蒸馏水溶解成1000ml，为0.1MTris液，取0.1MTris液100ml，加0.5M醋酸镁20ml，和蒸馏水800ml，再用1％醋酸调节pH至8.8，然后用蒸馏水稀释至 1000ml。 6． 100 mg/ml诱导物IPTG（异丙基硫代-(-D-半乳糖） 7． 2x上样缓冲液 8． 猪肝脏 9． 蛋白酶K（20mg/ml） 10． 限制性内切酶ECoR I和Xba I 1．2实验方法 1．2．1 猪基因组DNA抽提[3] 利用基因组DNA较长的特性，可以将其与细胞器或质粒等小分子DNA分离。加入一定量的异丙醇或乙醇，基因组的大分子DNA即沉淀形成纤维状絮团飘浮其中，可用玻棒将其取出，而小分子DNA则只形成颗粒状沉淀附于壁上及底部，从而达到提取的目的。在提取过程中，染色体会发生机械断裂，产生大小不同的片段，因此分离基因组DNA时应尽量在温和的条件下操作，如尽量减少酚/氯仿抽提、混匀过程要轻缓，以保证得到较长的DNA。 取猪肝脏100mg于研钵中，加入500μl DNA抽提裂解缓冲液Ⅰ（TE缓冲液）后充分研磨，倒入EP管，再加1μl蛋白酶K（20mg/ml），56℃水浴4小时， 煮沸5min灭活蛋白酶K，冰浴5min。加入等体积酚-氯仿，旋涡振荡1min使之充分混匀后静置10min ，12000g离心10min ，取上清，重复加酚和氯仿抽提，离心后取上清，再于上清液中加入等体积异丙醇，旋涡混匀，静置10min 后12000g离心10min 。弃上清，加入1ml75%乙醇，7500g离心10min。弃酒精，真空干燥5min，加入20μl双蒸水溶解所抽提DNA。 1．2．2 琼脂糖凝胶电泳 （1）琼脂糖凝胶制备：配制1%的琼脂糖凝胶（准确称取1g琼脂粉，溶于100ml的TE缓冲液，并加入5μlEB染料液，混匀后放入微波炉加热5min。注意！EB染料液有毒，操作时要戴手套，小心操作）。 （2）制胶：待胶冷却到50-60℃时倒入制胶槽中。冷却后把胶放入电泳槽，加入适量TE缓冲液（刚好覆盖胶的上表面）。 （3）上样：取5μl扩增产物加入1μl 6×上样缓冲液，将6μl样品加入样品槽中。另1孔加5μl DL-2000 DNA Marker 指示条带。 （4）电泳：恒压80V，待染液迁移到前沿时停止电泳。 （5）电泳结果的观察：在紫外光投射仪中观察染色带。 1．2．3．基因定点突变引物设计 　利用聚合酶链式反应（PCR）进行寡核苷酸介导的基因突变。 突变位点在基因两端：通过突变引物引导合成，１对突变引物，１次PCR扩增。 突变位点在两端 引物设计原则： ① Tm值和G+C%含量相当 　　　　 ② 结构上避免3’端互补，避免产生引物二聚体。 扩增表达基因引物设计方法 ① 保证读码框的正确 ② 添加或选择酶切位点及添加保护性碱基（提高酶切效率） ③ 基因突变方式：同义突变、结构改变 根据本实验的目的及要求，要将第17位编码Cys的TGT突变为编码Ser的TCT，另外因为猪β-干扰素基因为真核生物基因，在原核细胞中表达时，由于密码子的偏好性不同，所以通过分析目的基因序列及相关密码子结构，要对下列基因进行同义突变：第3位编码Tyr的 TAT 突变为TAC，第7位编码Arg的CGA突变为CGT，第164位编码Arg的CGG突变为CGT。 综合考虑上述因素，通过相关设计软件，可设计得以下两引物： Primer 1 （59bp） IFN-pMal-mu 1 （由黄良宗老师设计合成） Primer 2 （33bp） IFN-pMal-mu 2 （由黄良宗老师设计合成）Primer 1 （59bp） IFN-pMal-mu 1 （由黄良宗老师设计合成） 5’ 3’：CGGAATTCAGCTACGATGTGCTTCGTTACCAAC