常用液相色谱柱原理使用与维护保养.ppt

* （4）样品必须经正确预处理后进样检测，包括： ①检测游离氨基酸含量时，需先除去脂肪杂质后，再上柱分析。 ②测定蛋白质的氨基酸组成时，样品必须经酸水解→去糖和淀粉→去脂肪→去核酸→去无机盐等过程后，再上柱分析。 （5）测定必须在pH5～5.5、100℃条件下进行；衍生化反应进行时间为10～15min；生成的紫色物质在570nm波长下测定，而生成的黄色化合物在440nm波长下测定。 （6）显色反应用茚三酮试剂极易被氧化，随着时间延长发色率会降低。故在较长时间测定样过程中应随时采用已知浓度的氨基酸标准溶液上柱测定以检验其变化情况。 （7）要注意氨基酸分析柱柱填料为疏水性高聚物薄壳型离子交换剂，最好确保流动相pH值在2～10范围内使用。余者，诸如老化、净化、保养等，请参考C18柱。 3、液相色谱柱常见问题分析与解决方案 这部分内容为长期实践积累，重点关注色谱柱使用中经常遇到的问题，并针对这些问题进行适当处理，以延长柱寿命。这些解决办法也不能保证百分之百有效，但一般情况下，可以尝试，往往能得到意外的惊喜。现根据常用液相色谱柱的常见问题分类别详述如下： 3.1普通C8及C18反相色谱柱（C8C18 Reversed-phase chromatography column） 当色谱柱使用较长时间之后，就可能发生柱压升高、分离度不好、柱效降低、峰形不好等情况，这时就需要根据故障原因对色谱柱进行清堵与再生，以延长色谱柱的使用寿命。具体原因及处理方法如下： （1）筛板堵塞与柱头塌陷：主要现象有柱压严重升高或不稳定、色谱峰拖尾、色谱峰变宽、色谱峰分叉、秃峰等，需要进行清堵与弹性复原处理。（此方法适合于任何类型有相同故障的色谱柱的处理，不同的是溶剂要与相应类型色谱柱匹配。）主要处理方法如下： ①一般情况下，将色谱柱反接，不接检测器，用纯水或水-有机相（多用甲醇、乙腈）（95:5）以0.6ml/min流速冲洗约4h→再正向连接，接或不接检测器，用纯水或水-有机相（多用甲醇、乙腈）（95:5）以0.6ml/min流速冲洗约1h→再提高流速至1.0ml/min冲洗1h，观察柱压变化。若不凑效，则拧开柱头螺母（色谱柱进口），小心取下筛板，用5%左右的硝酸溶液超声处理20min左右，再用纯水超声20min左右。用小勺清理掉柱进口污染的部分填料，再将用乙醇调和后的相应的硅胶装入柱入口（也可用已经报废的同类柱中的填料替代），用平面不锈钢小铲压紧填平至略高出柱管口，但量不宜太多，否则，压得太紧柱压会升高，然后装上清洗过的筛板，注意筛板安装方向必需与原装相同，最后紧固。 ②冲洗与饱和：清堵紧固后，先反向连接色谱柱，不接检测器，用纯水或水-有机相（多用甲醇、乙腈）（95:5）以0.3ml/min流速冲洗约4h→再换成甲醇以0.5ml/min流速冲洗约2h→再正向连接色谱柱，接或不接检测器，用纯水或水-有机相（多用甲醇、乙腈）（95:5）以0.3ml/min流速冲洗约2h→再换成甲醇以0.5ml/min流速冲洗约1h→然后用甲醇或乙腈以1ml/min流速冲洗约1h以上，再根据测试用流动相比例调整水-甲醇（或乙腈）比例，以1ml/min流速冲洗约1h，最后用测试用流动相平衡2h，进样测试即可。 ③特别说明：如不是特殊情况，按其他办法可行，则最好不要反冲色谱柱和拆卸筛板。 （2）柱效降低：主要特征性现象有柱压基本正常，但出现拖尾峰、秃峰、分叉峰、前延峰、峰变宽、基线漂移、理论板数降低、分离度降低等。需要进行再生处理，具体方法如下： ①一般情况下，顺接色谱柱，按如下溶剂顺序及条件冲洗：95%水-5%甲醇（或乙腈）（1.0ml/min，1h以上）→100％甲醇（1.0ml/min，1h以上）→100％乙晴（1.0ml/min，1h以上）→75％乙晴-25％异丙醇（0.5ml/min，10倍柱体积以上）→100％异丙醇（0.5ml/min，10倍柱体积以上）→100％二氯甲烷（0.5ml/min，10倍柱体积以上）→100％正己烷（0.5ml/min，10倍柱体积以上，根据实际情况可忽略）→100%异丙醇（0.5ml/min，20倍柱体积以上）→95%水-5%甲醇（或乙腈）（0.5ml/min，30min；再升至1.0ml/min，10倍柱体积以上）→检测用流动相平衡2h或至基线平稳，进样测试。在冲洗过程中，随时关注柱压变化，确保不超过4000psi；若超出，可通过降低流速，升高柱温来调整，具体操作可咨询具备相关专业知识背景和实践经验的人士。 ②若上述方法效果不理想，可按如上溶剂顺序和条件，先反接色谱柱冲洗→再顺接色谱柱，用100%乙腈以1ml/min流速冲洗约2h→再用与流动相同比例的水-有机相以1ml/min流速冲洗约30min→最后