ELISA操作注意点讲义.ppt

BIOCHEMMU TECHNOLOGY 操作注意点 ELSIA试剂盒 上海千慕生物科技有限公司 2007年4月20日 样品制备 按照试剂操作介绍准备样品 在样品和溶剂混合后震荡充分,保证检测物质充分提取出来(饲料内毒素检测) 有挥发性的溶剂(如甲醇)需要用带盖的容器 在混合后过滤后,请观察滤液是否还浑浊不清.如果还是有些浑浊说明过滤不完全,可以通过离心或者再次过滤后使用,这样可以避免过多的背景干扰 试剂的准备 试剂盒从冰箱取出后,必须恢复到室温25度才开始检测,大概1-2小时左右恢复到室温.冬天需要室内开空调到25度 对于冲洗缓冲溶液需要稀释10倍方可备用 有一些试剂的酶偶合物需要稀释备用,毒素都是即时使用 另外有些标准品也需要每次实验逐级稀释制备成检测所需浓度(对于一些容易分解的标准品,多数是抗生素类药物,比如新霉素,泰乐菌素,以及四环素等等) 显色液: 即时使用 终止液: 即时使用 每次实验,计算所需要的足够量的试剂,然后把试剂转移到移液槽,以免直接吸取导致整瓶试剂污染 操作过程 加样前事先准备好操作手册,确认每一次添加试剂名称,并且注意每次的添加试剂的量. 规范加样的手法: 加样头不能接触孔壁,也不可以把头伸入孔内 操作过程 每次加样必须使用新的加样头, 不能洗涤后重复利用, 加样头需要紧密的套在加样枪上，保证准确的取样量。 在正确的加样方法保证下,加同一种试剂可以使用同一个加样头,以确保加样的连续性和快速, 特别注意：不能在加样过程中出现中断, 出现中断对于结果的精确性有影响。 如果通过多道加样枪来加样,必须观察每次吸样量是否一致, 如果有个别道液面明显较低,需要重新吸取。如果检测样品量小可以不用多道， 但是对于需要预混合的试剂盒,则为了加快加样的速度,必须要用多道. 尽量选择性能优越的多道加样枪。 第一步培养 完成添加样品、标准品和Conjugate后（双抗体法则需要加完二抗后再培养），立即按下即时表，开始培养。 培养过程中不能震荡 确保培养时间不能超出规定时间 培养温度需要在室温25度 培养过程中需要避光（可以用盖子盖住） 在培养期间，准备好冲洗缓冲液，以便在培养完成后立即开始冲洗 冲洗 冲洗是影响结果非常重要的一个环节，所以必须充分彻底。 培养时间到后，立即把微孔内的液体甩掉。 最好使用多道加样枪进行冲洗（300ul量），这样可以确保没有气泡产生。如果没有多道也可以用洗瓶，但是可能会浪费一部分冲洗液，洗瓶需要带尖嘴，这样逐个把微孔充满后，用力甩掉液体，这样重复5-6次最好。 冲洗后，在阳光下查看在微孔底部是否有气泡，如果是则需要再清洗一次，把气泡给去掉，直到没有气泡，拍干多余水分后马上进行下一步操作，千万不要中断，以免孔内液体干掉。 冲洗完成后，用纸巾吸取微孔板表面和周围多余的液体。 冲洗液最好不要使用蒸馏水等等，因为可能会破坏结合着的抗原抗体结合物，但是冲洗缓冲溶液是土温20等的物质可以保护结合物。 冲洗液温度必须是室温25度左右。 加发展液 在第一步培养过程中，可以准备发展液，就是把计算好的发展液量从试剂瓶转移到试剂槽内 检查发展液是否有淡淡的蓝色，如果有，证明已经被污染，要检查空白值是否非常高，超出规定值的，实验无效，更换新的试剂重新检测。 同样用多道加样枪吸取试剂，添加到检测微孔，对于呕吐和黄曲霉毒素，可以使用单道加样枪。但是单次检测最好不要超过24个微孔。 加样后轻微震荡一下（几秒钟） 第二部培养 完成发展液的添加后，把检测板放在避光处培养，培养温度仍然是室温25度左右 培养过程中不能振荡，如果振荡培养会导致结果发生偏差，整体OD值偏高 在培养结束时查看，是否蓝色比较浅，如果是非常浅则最好延长一下培养时间（可以考虑增加5分钟），直到通过肉眼可以分辨颜色梯度。如果是非常明显的蓝色，则不需要延长培养时间。 加终止液 在第二步培养过程中，准备终止液的量，转移到试剂槽。 样品量大的使用多道加样枪来添加终止液，如果是小量的样品检测，可以一直使用单道。请使用性能优越的多道加样枪。 有时加完终止液后没有完全变成黄色，则需要微孔内液体全部变成黄色才能进行读数 一个小时内完成读数，450nm光栅 谢谢！ * * *