ELISA实验讲义.pptVIP

酶联免疫吸附实验(ELISA) 将待测血清1:100稀释后（198ul稀释液+2ul血清）加入到每排第1孔，取100ul稀释液到其它孔（每排2-10孔）再将第一孔做倍比稀释到各孔，每孔100μl，见表。注意混匀。 100ul 血清稀释及加样 1: 100 1: 200 1: 400 1: 800 1: 1600 1: 3200 1: 6400 1: 12800 阴性 血清 阳性 血清 1: 100 1: 200 1: 400 1: 800 1: 1600 1: 3200 1: 6400 1: 12800 Blank Blank 初免 再免 198ul稀释液+2ul血清 100ul 1 目的和要求 掌握ELISA的原理、操作过程及注意事项 了解ELISA实验结果的读取和分析 实验原理 借助酶标记抗体（或抗原）在体外与抗原（或抗体）结合，通过相应底物被酶解后出现显色反应。反应颜色深浅与抗原（或抗体）量的多少有关。 特点：灵敏、特异 类型： 双抗体夹心法、竞争法、间接法等 双抗夹心法ELISA 实验材料 BSA包被的测定板 酶标抗鼠IgG抗体 待检血清，阳性血清，阴性血清 洗涤液： PBS＋吐温-20 底物液：四甲基联苯胺（TMB） 终止液：10% H2S04 实验步骤 洗板（已包被抗原） 加入稀释好的待测血清每孔100ul， 37℃孵育30min 加入100ul酶标抗体, 37℃孵育30min 洗板3次,每次1min 洗板3次,每次1min 实验步骤 加入100ulTMB底物液避光室温孵育15min 终止反应:每孔加1滴10％硫酸 结果观察 注意事项 加样：应将所加物加在ELISA板孔的底部，并注意不可溅出，不可产生气泡。 洗板：每次洗液加入后，应静置1分钟使清洗更加彻底。末次洗板尽量将水甩干。 液体全部加完后，可将酶标板在桌子上平行轻轻晃动30秒，混匀液体。 底物有毒性，终止液对皮肤有腐蚀性，尽量避免接触。 抗体产生的一般规律 初次应答和再次应答规律。 抗体产生的顺序规律： IgM - IgG,IgA,IgE 初次应答和再次应答抗体产生比较 因为ELISA 是抗原与抗体反应，所以特异性很高 ELISA又是借助了酶的放大反应，所以灵敏度高 因为ELISA 是抗原与抗体反应，所以特异性很高 ELISA又是借助了酶的放大反应，所以灵敏度高