第十四章基因工程制药工艺摘要.ppt

（4）PCR扩增反应体系组成 50mL 总体积 稀释 27～33mL H2O 含目标基因序列 5～10mL 模板DNA 辅酶 1mL 1～5mmol/L MgCl2 催化，热稳定 1～2mL 1～5U/mL DNA聚合酶 扩增的终止点 2.5mL 20mmol/L 反向引物 扩增的起始点 2.5mL 20mmol/L 正向引物 反应的底物 1mL 20mmol/L dNTPs 提供反应环境 5mL 10× 缓冲液 作用 用量 浓度 成分 基因工程制药 大肠杆菌的构建技术 （5）PCR扩增产物 94℃，1min 94℃，30s 94℃，5min 变性 1 94℃，7-10min 55℃，30s 第三个反应 30-35 72℃，1min 55℃，30s 第二个反应 1 第一个反应 循环数 聚合 退火 反应 基因工程制药 大肠杆菌的构建技术 概念：在特异位点上催化dsDNA分子的断裂，产生相应的限制性片段。 酶切体系组成：目标和质粒DNA，缓冲液，限制性内切酶。 反应条件：适宜温度(37℃)，1小时以上。 终止反应：加热；加入EDTA，螯合镁离子。 电泳检查：酶切完全性。 2、酶切反应 基因工程制药 大肠杆菌的构建技术 粘性末端 平头末端 基因工程制药 大肠杆菌的构建技术 3、连接反应 概念： DNA 双链上相邻的3′-羟基和5′-磷酸基因共价结合形成