通冠胶囊对骨髓单个核细胞向损伤血管内膜迁移分化的影响.pptVIP

通冠胶囊对骨髓单个核细胞向损伤血管内膜迁移分化的影响 研究背景 骨髓干细胞是一类具有自我更新和多项分化潜能的细胞。 如何诱导骨髓干细胞的分化、迁移、归巢仍是当前研究的热点。 已有研究证明多种细胞因子、药物等可以促进和动员骨髓源内皮祖细胞分化，进而修复损伤血管内膜。 研究目的 探讨益气活血类中成药通冠胶囊对骨髓单个核细胞向损伤血管内膜迁移分化的影响。 通冠胶囊组成：丹参、黄芪、水蛭等。广东省中医院制剂，0.5g/粒 。 处方来源 通冠胶囊根据方剂配伍规律结合中药药理研究拟方而成，得到邓铁涛教授的首肯，认为组方严谨，药简力宏，君臣佐使，配伍得当。 研究方法 Wistar大鼠30只（180-220g），10只为干细胞供体，余20只纳入实验，治疗组、对照组各10只，1周后，予颈动脉内膜损伤。 颈动脉损伤后24小时内经尾静脉注射经PKH26标记的骨髓单个核细胞5×106个/只。治疗组通冠胶囊（600mg/kg/d）灌胃，对照组等量的生理盐水灌胃，4周。 PKH26的特性 PKH26是一种亲脂性的荧光染料，它可以与细胞膜不可逆地结合，对细胞进行荧光标记。 在551nm激发光的作用下可发出波长为567nm的红色荧光。在适当的标记后，不影响细胞的活力。 随着细胞的分裂，标记物等份地分配到两个子细胞。用PKH26标记红细胞在体内半衰期可达100d。 根据这些性质PKH26被广泛用于细胞的标记、示踪。 颈动脉内膜损伤模型 大鼠骨髓单个核细胞的提取方法 无菌条件下取大鼠的股骨，纱布剥离骨头表面的肌肉及组织，骨骺端钻孔。 5ml注射器抽取5ml的PBS液，由股骨的骨骺端冲出骨髓血，连冲3次，离心，弃上清，3ml的1640重悬。 将含有骨髓血的1640液，1：1平铺于大鼠淋巴细胞分离液上（天津津脉），水平离心，2000r/min，15min。 吸取白膜层（第3层）于离心管内，加入4mlPBS液，1500r/min，5min，洗3遍。 PKH26染骨髓单核细胞的方法 加入lm l Diluent C重悬细胞，轻轻吹打细胞。 染色之前即刻，在含有1mlDiluent离心管中配制4×10 mol/L（4μl）的PKH26染料。 迅速均匀地将1ml的细胞液和含有1mlDiluent的染料液相混合，轻轻吹打、混匀。 25℃孵育2～5 min，不时吹打混匀。 加入等量的血清（2ml）终止反应， 放置1min。加入等量的完全培养液稀释。 1500r/min,5min. 弃上清。无血清培养液3ml重悬细胞。 大鼠骨髓单个核细胞的提取 实验结果1 血管内膜再内皮化的面积：颈动脉损伤后3天、1周、2周，1％的Evans blue 2ml经尾静脉注射，生理盐水灌流5分钟后，取出损伤部位的颈总动脉长约1cm，血管纵向切开，平铺固定。 实验结果2 计算血管内膜中膜厚度：3周后将两组大鼠的损伤颈总动脉冰冻切片，行HE和弹力纤维染色，光镜下，图像分析，计算两组的内膜、中膜厚度和比值。 通冠胶囊对球囊损伤后内膜增殖影响 实验结果3 观察PKH26标记的骨髓干细胞在损伤动脉内膜处的表达：取颈总动脉冰冻切片，室温下避光1h，中性树胶封片，在荧光显微镜下观察，发红色荧光和绿色荧光的血管内膜。 实验结果4 药物干预后，ELISA法检测两组大鼠血清中基质细胞衍生因子-1（SDF-1）、血管内皮细胞生长因子（VEGF）的浓度，探讨通冠胶囊动员内皮祖细胞的分子机制。 讨 论 骨髓干细胞与内皮祖细胞 生理作用：骨髓单个核细胞含有造血干细胞、骨髓间充质干细胞、内皮祖细胞等细胞成分，其均为单细胞组成，故称为骨髓单个核细胞,具有多向分化潜能。 损伤修复：EPCs具有高度分化和增殖潜能，在特定的生长条件下可分化为EC，在损伤血管修复中的作用至关重要，所以EPCs是内皮完整性得以维持的决定性因素。当EC受到损伤或发生凋亡时，EPCs作为内皮补片添补坏死细胞造成的空缺。 长期和反复暴露于心血管危险因素最终耗尽内皮细胞内源性抗炎系统的保护效应,不但造成内皮功能异常而且使内皮细胞失去完整性,造成细胞衰老脱离循环。 反映内皮细胞或内皮细胞膜（内皮微粒）脱离 后期研究 EPCs的分离、培养 EPCs染色与鉴定 通冠胶囊对EPCs周期的影响 通冠胶囊对EPCs的迁移影响 通冠胶囊对EPCs的迁移影响 通冠胶囊对EPCs的粘附作用 正在进行实验 Western blotting检测Akt、VEGF、eNOS蛋白的表达，以探讨通冠胶囊动员骨髓内皮祖细胞修复损伤内皮的细胞信号传导通路。 通冠胶囊的前期研究基础 张敏州，李松，邹旭，等.通冠胶囊对冠心病介入术后血脂含量和凝血功能的影响.广州中医药大学学报.200