位点特异整合型微环dna的实用性.docVIP

位点特异整合型微环DNA的实用性 ; 1.LR重组反应; 在LR克隆酶作用下,亲本质粒pEGFP-PP和pTPO-PP发生重组反应,形成微环DNA和微质粒(图1)。LR重组反应体系为:亲本质粒200ng、10×TE缓冲溶液1μl、LR克隆酶2μl、加ddH2O至10μl。反应条件:25℃,4h。1.2.4转染HeLa细胞将HeLa细胞消化传代至12孔板,于细胞汇合度为80%~90%时进行转染。参照转染试剂GenJetPlus说明书进行。主要步骤如下:移除培养液,以PBS冲洗细胞2遍,加入600μl无血清DMEM培养液。然后配制转染复合物:在1.5mlEP管内加入DNA混合物,以无血清DMEM补足50μl,混匀。实验组DNA混合物为未纯化的LR重组体系10μl和4倍于微环DNA物质的量的pPGKPhiC31obpA质粒。对照组DNA混合物为与微环DNA等物质的量的对照质粒和5倍于对照质粒物质的量的pPGKPhiC31obpA质粒。因实验组LR重组产物中含有与微环DNA等物质的量的表达ΦC31整合酶的微质粒,故上述实验组及对照组DNA混合物中微环DNA及对照质粒的物质的量与ΦC31整合酶质粒物质的量比值均为1:5。在另一1.5mlEP管中按照DNA(μg):转染试剂(μl)为1:3的比例加入GenJetPlus转染试剂,以无血清DMEM补足50μl,混匀。将上述转染试剂稀释液加入DNA混合物中,轻轻吹打混匀,室温静置20min后,将100μl转染复合物逐滴加入12孔板中,轻轻摇匀。另设不转染质粒的空白对照组。转染12h后,换新鲜的含血清DMEM培养液继续培养。; 2.LR重组效率测定; 以EcoRI酶切pEGFP-PP的LR重组产物来鉴定重组反应的发生:若发生重组,则微环DNA(pEGFP-MC)和微质粒分别被线性化,得到约2.0和5.3kb两条带;若未发生重组,则亲本质粒被切成约1.2和6.1kb两条带。以PvuⅡ酶切验证pTPO-PP的LR重组:若发生重组,则能切出约2.7kb(pTPO-MC)和5.3kb(微质粒)两条带;若未发生重组,则能切出约1.9和6.1kb两条带。可通过观察电泳图中各条带亮度粗略判断LR重组效率。此外,应用荧光定量PCR方法检测各质粒的拷贝数可较为精确地计算LR重组效率。在亲本质粒λattR两端设计引物MC-F和λattR-R(序列见表1)扩增该质粒的特有片段,检测亲本质粒的拷贝数;同时,设计引物MP-F和MP-R(序列见表1)扩增LR重组反应前后拷贝数不变的片段,作为定量PCR内参。以ddH2O替代LR重组反应体系中的LR克隆酶作为LR重组反应前样品。将两组亲本质粒pEGFP-PP和pTPO-PPLR重组反应前后样品分别稀释100倍和1000倍进行荧光定量PCR,通过标准曲线法进行绝对定量,比较LR重组反应前后亲本质粒的拷贝数,获得LR克隆酶的重组效率。; 3结果; 3.1LR重组效率鉴定结果; 酶切鉴定电泳结果显示,重组体系中微环DNA和微质粒的条带亮度明显高于亲本质粒(图2A),直观地表明LR重组效率较高。荧光定量PCR检测结果可见,由两组亲本质粒pEGFP-PP和pTPO-PP的两个稀释梯度得出LR重组效率为82.56%±0.76%(表2)。GFP阳性细胞克隆中LR重组片段PCR鉴定结果表明,随机挑选的27个GFP阳性细胞单克隆中有23个为微环DNA整合(图2B、图2C),即LR克隆酶重组效率为85.19%(23/27),与荧光定量PCR结果一致。; 3.2转染率的测定结果; 流式细胞分析结果显示,微环pEGFP-MC的转染率显着高于传统质粒pEGFP-C,为其3.66倍(24.80%±10.21%vs.6.77%±1.61%,P=0.039,3次独立实验,图3A)。; 3.3整合率的测定结果; 转染2周后,克隆计数并计算外源基因在细胞基因组中的整合率。结果显示,微环pEGFP-MC和传统质粒pEGFP-C的整合率分别为0.82%±0.11%和0.52%±0.07%(图3B)。虽然微环DNA的整合率仅为传统质粒的1.58倍,但两者相比有显着统计学差异(P=0.014,3次独立实验)。; 3.4蛋白表达水平的测定结果; 以流式细胞仪检测经PCR鉴定为微环DNA整合的23个细胞克隆以及对照组pEGFP-C整合的8个细胞克隆的GFP荧光强度,分别为(958.60±328.11)和(137.99±83.46)(图3C),前者为后者的6.95倍,有极显着统计学差异(Plt;0.001)。此外,ELISA检测pTPO-MC和pTPO-C在转染后不同时期hTPO的表达水平,结果如图3D所示。转染2、4.5、7、9.5d时,微环pTPO-MC组hTPO蛋白表达水平均明显高于传统质粒组,前者为后者的4~12