ELISA方法诊断隐孢子虫抗原供参习.docVIP

单抗介导的夹心ELISA方法的建立 摘要：将纯化的隐孢子虫卵囊制备免疫原，经油相苗、水相苗共6次免疫，制备了兔抗安氏隐孢子虫抗体。提纯后用HRP标记Ig抗体IgG浓度为1.755 mg/mL，酶/抗体摩尔比为1.18。选用3B10单抗与酶标兔抗建立了夹心ELISA试验，单抗的最佳稀释度为1：200，酶标抗体的工作浓度为1：400～800。在3种待检样品的处理方法中，以样品经超声波破碎后置液氮--37℃反复冻融后再检测，效果最好；乙醚脱脂处理后再同上处理，结果OD值稍低；未经冻融处理的隐孢子虫卵囊液比同滴度的处理样品OD值显著偏低。夹心ELISA最低检出限为含100个卵囊/mL粪样。特异性试验表明：该方法对于同属于隐孢子虫属的猪小球隐孢子虫、鸵鸟隐孢子虫有较高的识别力，其OD值与牛C. andersoni接近,而卵囊浓度相同的鸡球虫和猪等孢球虫的OD值则显著偏低。 引 言 目前，隐孢子虫的诊断方法主要有直接镜检、染色镜检、免疫学方法(如ELISA和IFAT)及PCR方法等。目前研究较多的是免疫学方法和分子生物学方法。1990年Robert报道了检测牛粪便中卵囊抗原的ELISA方法，取得了较好的效果。目前，国外已有商品ELISA检测试剂盒。国内张西臣1996年报道了双抗体夹心ELISA检测病原的初步研究，尹继刚应用双夹心-ELISA对60份牛粪便样本检查,并与抗酸染色法比较发现, ELISA敏感性比抗酸染色强，且不与牛球虫、结肠小袋虫发生类属反应。作者在前两个试验的基础上，初步进行了夹心ELISA试验，为今后制备诊断试剂盒，用于水源、环境中隐孢子虫的检测做前期的准备。 1.材料与方法 1.1材料 1.1.1单抗与多抗 抗牛源安氏隐孢子虫的单克隆抗体制备见实验二，使用的为其中的3B10单抗，上清效价为6400，腹水效价为102400。多抗为兔抗牛源安氏隐孢子虫抗体，琼扩效价为1：8。酶标单抗和酶标多抗均为自己标记。酶标羊抗鼠二抗购自北京中山金桥生物公司。 1.1.2实验动物 健康无隐孢子虫的雄兔和雌兔各一只，购自中牟县某养兔场，各种隐孢子虫、球虫、猪等孢球虫均为本实验室分离保存。 1.1.3　试剂及器材: 抗体提纯试剂及器材同实验二 标记试剂及器材　　(1)　0.1M NaIO４：称取241mg高碘酸钠(上海浦东化学试剂厂溶于蒸馏水10mL中。　　(2)　1mM PH4.4醋酸钠缓冲液:　　0.2M NaAc(天津科密欧化学试剂开发中心 (1.361克／50mL) 3.7mL　　0.2M HAc (0.601mL／50mL) 6.3mL　　加蒸馏水至2,000mL。　　(3)　0.2M PH9.5碳酸盐缓冲液:　　Na２CO３ 0.32克　　NaHCO３ 0.586克　　加蒸馏水至50mL　　再用蒸馏水作20倍稀释，即成0.01M PH9.5的碳酸盐缓冲液。　　(4)　NaBH４（FLUKA进口分装溶液(4mg／mL): 　　临用时称取NaBH４4mg溶于1mL蒸馏水中。　　(5)　0.01M PH7.4 PBS。　　(6)　PH7.8饱和硫酸铵溶液及半饱和硫酸铵溶液。　　(7)　萘氏试剂　　(8)　纯化的兔抗牛安氏隐孢子虫IGg抗体。　　(9)　HRP(上海雪满生物科技有限公 RZ3.0，酶活力：300u以上/mg)。　　(11) 搅拌器，分光光度计，离心机。　　(12) 透析袋，大、小烧杯，试管，吸管等。 ELISA试剂及器材见实验二　　 1.2方法 1.2.1兔抗牛源安氏隐孢子虫抗体的制备 隐孢子虫抗原，采自西郊某奶牛场阳性牛，经蔗糖浓度梯度离心纯化后，用PBS调整卵囊浓度为2×108个/mL左右。将上述提纯卵囊置超声波细胞粉碎仪上以80%的功率粉碎6分钟，然后将粉碎物置液氮和和37℃冻融5-6次，经3500rmin-1离心10分钟，测定上清中性液蛋白含量，可溶性抗原用于抗体检测，使用部分可溶性抗原和全部沉淀（非可溶性抗原）制备免疫原。将上述抗原的一部分（冻融的上清和破碎的卵囊碎片）混合物加2倍量的弗氏完全佐剂乳化制成油苗。另一部分不加油佐剂，作为水苗。 免疫，首先用油苗免疫，每只兔子免疫1mL,背部皮下多点注射和腹腔注射相结合。免疫兔用全价饲料饲养于清洁动物房内。 免疫兔从颈静脉放血，血液置于灭菌平皿中，于37℃自然析出血清。 1.2.2兔抗牛安氏隐孢子虫IGg抗体 IgG抗体标记(1)称取5mgHRP溶解于1mL双蒸水中。(2)于上液中加入0.2mL新配的0.1M NaIO４溶液，室温下避光搅拌20分钟。(3)将上述溶液装入透析袋中，对1mM PH4.4的醋酸钠缓冲液透析，4℃过夜。(4