细胞冻存时间对脾脏细胞新陈代谢的影响(实验设计).docVIP

【实验目的】 1．细胞冻存时间对脾脏细胞新陈代谢的影响。 2. 熟悉细胞培养过程中的无菌操作技术。 3．了解细胞原代培养和传代培养的基本方法和主要操作步骤。 4．了解体外培养细胞的液氮冻存与复苏技术。 【实验原理】 滋养层细胞的制备 在体外培养细胞实验中，对于难养的细胞或者数量较少的细胞，常常需要预先在培养瓶或培养板底部加入一些活的原代细胞或者静息的肿瘤细胞以辅助目的细胞的生长，这就是滋养层细胞。至于滋养层细胞可以促进其它细胞生长的原理目前有两种解释：一种解释是滋养层细胞可以减小培养瓶或培养板对细胞的毒害作用；另一种解释是滋养层细胞可以释放出一些必要的生长因子，可以促进目的细胞的生长。在单抗制备过程中，刚刚融合的细胞和克隆化的细胞都比较难以生长，因此都需要添加滋养层才能较快地生长。在介绍滋养层细胞之前，先来介绍一下制备单抗的培养基体系。 RPMI 1640培养基（Roswell Park Memorial Institute Medium 1640） RPMI 1640培养基（下面简称1640）最初是Roswell Park Memorial Institute用来培养人的淋巴细胞的培养基，后来被广泛地应用到大部分悬浮细胞的培养中。商品化的1640大多以固体形式出售，也有少数是配好的液体。有的商品化1640中不含碳酸氢钠（稳定pH作用）、不含HEPES（稳定pH作用）、丙酮酸钠（提供碳源）、谷氨酰胺，配制前需要仔细阅读说明书，按照说明书的要求加入需要额外加入的成份，尤其是谷氨酰胺，它是细胞增殖必不可少的成份，而且谷氨酰胺特别容易分解，配制完培养基后应该尽快用完，暂时不能用完的放在4℃或者-20℃保存。大部份商品化的1640培养基中都含有酚红作为酸碱指示剂，1640的pH为7.2-7.4，指示剂显示为红色（如果偏酸则显黄色，偏碱则呈紫色）。 ??DMEM培养基（Dulbeccos Modified Eagles Medium） 是在Basal Medium Eagle的基础上改进的，最初用于鼠胚胎细胞的培养，后来广泛地应用于各种贴壁细胞的培养或者发酵罐培养。与1640培养基相比，DMEM培养基营养更为丰富。DMEM培养基有两种类型，一种是高糖型，主要用来培养高密度悬浮细胞，另一种是低糖型，主要用来培养普通的贴壁细胞。与1640培养基一样，商品化的DMEM培养基使用之间也要按照说明书的要求添加指定的成份。 ??由于单抗制备（小鼠）中的杂交瘤细胞是半贴壁型的细胞，因此上述两种培养基都可以用来培养杂交瘤细胞。但是这些培养基并不能直接使用，而在使用之前需要加入15%-20%胎牛血清（推荐使用Hyclone公司、Gibco公司或四季青公司胎牛血清），胎牛血清可以为细胞提供更多的生长因子和激素等活性物质，添加了胎牛血清的培养基称为完全培养基，否则称作不完全培养基。在单抗制备中，由于需要进行选择性杀死非目标细胞，所以使用添加HAT的选择性培养基，通常HAT中，H（次黄嘌呤）的浓度为1×10-4M，A（氨基蝶呤）为4×10-7M，T（胸腺嘧啶）为1.6×10-5M，在HT培养基中，只需要不加氨基蝶呤，其它都同HAT。另外，在细胞培养中，一般都加入抗生素防止细胞污染，通常用的抗生素有青霉素（100U/ml）和链霉素（100ug/ml）、四环素(50ug/ml)、庆大霉素（50ug/ml），其中青霉素和链霉素联合使用较为常用，俗称“双抗”。由于细胞培养中几乎所有的成份对高温都不稳定，所以绝对不能使用高温灭菌，而是采用0.22um滤膜过滤除菌。通常，先配好不完全培养基（要加抗生素），然后在超净台上抽滤、分装，取少量分装的培养基加入至液体LB培养基里37℃培养过夜进行无菌测试，其它的培养基则放在-20℃保存。确认培养基无菌后才能使用。HT、HAT则配成相应的母液（可用PBS配制，也可以用不完全培养基配制，一般配为50×浓度保存）。培养基使用前根据需要加入HAT或HT以及血清才可以使用。脾脏细胞。脾细胞与杂交瘤的来源细胞上有很高的同源性，因此与杂交瘤的“兼容性”较好，是作为滋养层的不错选择。其制备方法和腹腔巨噬细胞过程类似，只是需要剪开腹膜，取出脾脏，用镊子剥去脾脏外的结缔组织，将脾脏放在200目不锈刚细胞筛网上，用5ml注射器的针芯挤压脾脏，使分散的脾细胞通过筛网落入下面的容器（建议使用一次性培养皿，养细菌用的那种比较便宜），用少量不完全培养基冲洗、吹匀脾细胞，收集离心，计数稀释同腹腔巨噬细胞制备过程，一只老鼠的脾脏细胞总数约为2×108-3×108个，以96孔为例，每孔需要约1×105个脾细胞。其制备方法是：杀死小鼠，用酒精浸泡数分钟，取出小鼠放在解剖板上，用大头针固定好四肢，在超净台上用一个镊子挑起腹部皮肤，用手术剪刀剪开腹部皮肤，换一把干净镊子