细胞培养的操作步骤(修改3).docVIP

传代细胞培养的视频拍摄脚本 一、 实验准备 器材 液氮冷冻灌、 恒温培养箱、 电冰箱、高压灭菌锅、磁力搅拌器、 离心机、 分析天平、倒置显微镜、 超净工作台、弯头吸管（1个）、胶头滴管（9个）、 离心管（9个）、 带塞培养瓶（不定个）、 试管架、 量桶、 烧杯、酒精灯、 抽滤瓶、G6型号细菌过滤漏斗、带塞小玻璃瓶，大三角瓶 、无菌冻存管、液氮瓶 （一）、器皿 1玻璃器皿的清洗灭菌： 种类：小玻璃瓶、弯头吸管、滴管（3个）、培养瓶、量桶、 烧杯、抽滤瓶、大三角瓶，细菌过滤器接口管 药品：5％盐酸溶液、重鉻酸钾120ml、硫酸200ml、蒸馏水200ml （1）浸泡:新使用或重复使用的玻璃器皿须经5％盐酸溶液或自来水浸泡过夜或煮沸30min，水洗。以去除新购进玻璃器皿所带有灰尘、铅、砷等物质，并消除其弱碱性。 （镜头一：实验人员将器皿放进加有5％盐酸溶液的盆内，并以字幕和配音的形式显示浸泡或煮沸时间和浸泡目的） （2）刷洗:浸泡后用软毛刷和优质的洗洁精进行刷洗。刷洗后经行烘干 （镜头二：实验人员刷洗器皿，使用正规的清洗方法，并烘干，只示范其中2--3种即可，实验人员必须介绍操作示范烘干箱的使用方法和相关数据的设置方法） （3）酸浸:刷洗后的玻璃制品酸浸前须适当晾干或烘干，以免造成酸浸液稀释，影响效果。将玻璃制品完全浸泡入清洁液中24h。清洁液具有极强酸蚀作用，操作过程需戴防护用具。 （镜头三：带好橡胶手套将清洁液加入到盆中，让后进行酸浸，并以字幕的形式显示浸泡时间） （4）冲洗、烘干备用:浸酸后的玻璃器皿先用自来水充分冲洗，吸管需冲洗10min，器皿需每瓶灌满自来水、倒掉反复10次以上，不留任何酸浸液残迹，然后用蒸馏水漂洗2～3次 将清洗好的玻璃器皿放入烘干箱中，烘干后的玻璃器皿要求干净透明，无油烟，不能残留任何有害物质及化学药品等。 （镜头四：自来水冲洗，蒸馏水清洗，烘干一起完成，在这个过程中可在装器皿的盘中放入一定量的玻璃器皿，只对其中一种进行自来水冲洗、蒸馏水清洗，洗好后就将所有仪器放入烘干箱中烘干，并在每一个步骤中以字幕或语音的形式显示相关操作次数和时间） （5）包装灭菌:器材经清洗烤干或晾干后，先应严格包装，然后再行消毒灭菌处理，以防止消毒灭菌后再次遭受污染。包装材料常用包装纸、牛皮纸、硫酸纸、棉布、铝饭盒、玻璃或金属制吸管筒、纸绳等。 （镜头五：实验人员对实验器皿中的1—2种进行包装示范，然后将其他包装过的器皿一起放入高压蒸汽灭菌锅中进行灭菌） （实验人员必须示范操作高压灭菌锅和恒温干燥箱的用法，示范操作步骤，只示范一次即可，在下面的不同灭菌温度和不同灭菌时间可以字幕的形式显示） 2、橡胶制品清洗消毒 种类：玻璃瓶橡胶塞、培养瓶瓶塞、皮管、滴管头 新的橡胶制品洗涤方法：0.5mol/L NaOH煮沸15分钟，流水冲洗，0.5mol/L HCl煮沸15分钟，流水冲洗，自来水煮沸2次，蒸馏水煮沸20分钟，50℃烤干备用 （镜头：0.5mol/L NaOH煮沸，流水冲洗，0.5mol/L HCl煮沸，流水冲洗，自来水煮沸2次，蒸馏水煮沸20分钟各一个镜头，因为在上面已经示范过干燥箱和灭菌锅的操作方法，在使用干燥箱和高压灭菌时只需以字幕的形式显示烘干温度、灭菌温度、灭菌时间即可） 3、塑料制品的清洗消毒 种类：瓶盖、离心管 塑料制品特点：质软、易出现划痕；耐腐蚀能力强、但不耐热。 清洗程序：使用器皿后立即用清水清洗，浸于自来水过夜，用纱布或棉签和50℃清洗液刷洗，流水冲洗，晾干，浸于清洁液15分钟，流水冲洗（15－20遍）,蒸馏水浸洗三次，双蒸水泡24小时，晾干备用。 （因在器皿的准备过程中玻璃制品是最主要的，故塑料制品的清洗和消毒灭菌的方法可用字幕的方法显示出来） （注意：各种不同材质器具的不同灭菌时间？温度设置？） 2、试剂准备 试剂 ：RPMI l640培养液, 小牛血清（生长因子）, 胰蛋白酶液，75%乙醇（消毒）,冻存培养液（培养液7ml，小牛血清2ml，DMSO 1ml)，PBS缓冲液等。 重点配置的药品：RPMI l640培养液、0.2%胰蛋白酶液。 药品：RPMI l640 培养粉、双蒸水、HEPES、碳酸氢钠、青霉素、链霉素；typsin粉末。 器材：大三角瓶、移液枪及枪头、无菌EP管、无菌室、无菌操作台、磁力搅拌器、G6型号细菌过滤漏斗、细菌过滤漏斗、冰箱。 RPMI l640基础培养液的配制?： 称取RPMI l640 培养粉 10.4g溶于1,000 mL双蒸水中,磁力搅拌器搅拌40min. 加HEPES 2、4g。搅拌十分钟，2g碳酸氢钠 搅拌十分钟 。过滤前要加双抗 加入双抗至最终浓度为 100单位/mL。过滤 经G6型号细菌过滤漏斗抽滤后备用 1、取RPMI l640培养粉10