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细胞工程复习资料 1原代培养——直接取自动植体的组织或细胞的培养。 2传代培养——从原代培养的细胞的继续转接培养称为传代培养。 3接触抑制——将多细胞生物的细胞进行体外培养时，分散贴壁生长的细胞一旦相互汇合接触，即停止移动并抑制生长的现象。 4密度抑制——虽发生接触抑制，只要营养充分，细胞仍然能够进行增殖分裂，但当细胞密度进一步增大，培养液中营养成分减少，代谢产物增多 时，细胞因营养的枯竭和代谢物的影响，则发生密度抑制。 5细胞系(cell line)——原代细胞经第一次传代后，形成的细胞群体，即具有增殖能力，类型均匀的培养细胞，一般为有限细胞系。 6细胞株(cell strain)——细胞系经过克隆或其他方法而得的单一类型的细胞群体。 7动物细胞培养的条件：充足的营养供给、适宜的温度、适宜的pH和气体环境。无菌、无毒的环境。 1）恒定的温度:37 ℃ 维持培养细胞旺盛生长，必须有恒定适宜的温度。人体细胞培养的标准温度为36.5℃±0.5℃，偏离这一温度范围，细胞的正常代谢会受到影响，甚至死亡。 2）PH：7.2-7.４ 当PH低于6或高于7.6时的生长会受到影响，甚至死亡。 3) 气体： 所需气体主要有氧气和二氧化碳。 氧气参与三羧酸循环，产生供给细胞生长增殖的能量和合成细胞生长所需用的各种成分。 CO2有调节PH的作用。 4）营养—培养基：在保证细胞渗透压的情况下，培养液里的成分要满足细胞进行代谢所需要的各种营养，如包括十几种必需氨基酸及其他多种非必需氨基酸、维生素、碳水化合物及无机盐类等。只有满足了这些基本条件，细胞才能在体外正常存活、生长。 8细胞培养实验室： 专用于组织细胞培养的空间，应包括更衣间、缓冲间、操作间。 内设超净工作台、培养箱等细胞培养的必要设备，应具备紫外消毒、通风及温控设施。 操作间放置净化工作台及二氧化碳培养箱、离心机及倒置显微镜等。 缓冲间可放置电冰箱、冷藏器及毒好的无菌物品等 9细胞保存原则：慢冻快融 冷却过慢，胞外溶液水分大量结冰，渗透压增大，胞内水分大量渗出 化学损伤 冷却过快，胞内水分来不及向细胞膜外渗出，胞内溶液中的水分结冰 物理损伤 在细胞冻存时加入冷冻保护剂，可以保护细胞免受冷冻损伤。 原理： 1）.常用的低温保护剂是甘油和二甲基亚砜（DMSO），它是一种渗透性保护剂，可迅速透入细胞，降低细胞的冰点 2）.提高胞膜对水的通透性，促进细胞内水渗出细胞外，减少细胞内冰晶的形成，从而减少冰晶对细胞的损伤；解冻时，促进细胞外水进入细胞内，缓解渗透性肿胀。 3）.稀释细胞内外未结冰溶液中的电解质，减少溶质损伤。 10配制冻存保护液： 在含20％—30％的小牛血清的1640培养基中加入二甲亚砜，使其终浓度为10％(或者加入甘油并使终浓度为5％)。 11细胞融合——又称体细胞杂交，是指将不同来源的原生质体(除去细胞壁的细胞)相融合将两个或多个细胞合并成一个细胞的技术。 12杂交细胞——在适当的条件下，细胞融合在一起，产生具有原来多个细胞基因信息的单个核细胞，称为杂交细胞 种内杂交细胞——同种细胞融合而成的细胞 种间杂交细胞——不同种的细胞融合而成的细胞 13非对称细胞融合——利用物理或化学方法使某亲本细胞的核或细胞质失活后再进行融合。 14 常用的诱导方法有三种：1. 生物法（病毒诱导法等） 2. 化学法（PEG诱导法、Ca 2+诱导法、溶血卵磷脂诱导法等） 3. 物理法（电诱导法等） 15自发细胞融合——是在未施加任何诱导条件的情况下所发生的细胞融合现象。 16人工诱导细胞融合是在人为条件下发生的细胞融合现象 17自发细胞融合现象在自然界中并不多见，常见的主要有以下几种情况： 1. 精子和卵子受精2. 肌管的形成3. 胚胎着床4. 巨细胞的形成5. 破骨细胞的形成6. 肿瘤细胞融合 18动物细胞融合影响因素： ①亲本细胞表面性质影响较大 ②细胞种类不同，融合效果也不同 ③细胞融合时需要适宜温度和运动状态 ④细胞融合过程中，通常耗氧量较大，缺氧时经常不融合。 ⑤有些细胞融合时需要Ca2+，否则不融合，细胞蛋白质亦发生变化。 ⑥最适合的pH为7.4-7.8之间，在此范围之外，融合率均较低。 19杂种细胞筛选方法：（1）遗传互补筛选法（2）营养互补筛选（3）温度敏感筛选法 1）遗传互补筛选法：利用每一亲本贡献一个功能正常等位基因，纠正另一亲本的缺陷，令杂种细胞表现正常。 亲本A：HGPRT- /TK+ 亲本B：HGPRT+ / TK- 杂交细胞：HGPR T+ / TK+