细胞活性测定.docVIP

细胞活性测定方法 细胞活性指标通常包括细胞膜对核酸染料的通透性，代谢活性，膜电位等核酸染料有多种，如EB带有单个自由正电荷，能通过完整细胞膜。而PI，TO—PRO—1，TO-PRO-3等等带一个有四铵基团和两个或两个以上正电荷的染料是不能通过完整细胞膜进入细胞内的。因而吸收了这些多电荷染料的细胞被认为是非活性的。另外，一些酸性染料，如上面提到的台盼兰，曙红等都是膜非通透性。 代谢活性是另一重要指标，它通过细胞内的酶的活性来判定。使用细胞某种酶的底物，它能通过（或是不能通过）完整细胞膜，在细胞内被酶切而产生荧光性，膜不通透性产物，能在细胞膜完好的细胞内存留，在细胞膜不完整的细胞内散失很快。通过检测荧光强度就可知细胞代谢活性。FDA(fluorescein diacetate)和CTC（5-cyano-2,3-ditolyl tetrazolium chloride）是常用的两种底物。前者虽然透过细胞膜的速度较慢，但它的产物基本不往外通透。后者经细胞内脱氢酶催化而具有荧光性，能提供细胞呼吸代谢系统活性和细胞膜完整性信息。正常细胞的细胞膜两侧维持着一个胞内为负的膜电位为梯度，带正电的亲脂性染料，如Cyanines类能因电梯度而通过细胞的脂双层膜聚积在活细胞内，带负电的亲脂性染料如oxonols会被排除在外。不再维持着膜电位梯度的细胞里，则会吸收更多Oxonols类染料。用流式细胞仪测量的方法优点是，灵敏，荧光强度精确定量，快速高通量的检测逐个细胞，可同时检测细胞的多个活性指标，提高可信度，结果具有统计意义。 缺点是，实验较MTT等复杂，费用较高常用的细胞活性测定方法有台盼蓝染色法、克隆（集落）形成法、3H放射性同位素掺入法、MTT法等。其中MTT法以其快速简便，不需要特殊检测仪器、无放射性同位素、适合大批量检测的特点而得到广泛的应用。但MTT法形成的Formazan为水不溶性的，需要加有机溶剂溶解，由于在去上清操作时会有可能带走小部分的Formazan，故有时重复性略差。为了解决这个问题，研究人员又开发了很多种水溶性的四氮唑盐类：如XTT、CCK-8（WST-8）等。MTT法 MTT：化学名： 3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝。检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲臜（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲臜，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。 它的特点是灵敏度高、经济。 缺点：由于MTT经还原所产生的甲臜产物不溶于水，需被溶解后才能检测。这不仅使工作量增加，也会对实验结果的准确性产生影响，而且溶解甲臜的有机溶剂对实验者也有损害。 MTT法显色的条件 （1）pH 值对MTT 实验结果的影响:MTT 实验体系的pH 值是影响实验结果的另一重要因素。在偏碱性的环境中本底偏高,稳定性较差。随放置时间延长而升高;偏酸性试液 的实验结果比较稳定。（2）酚红和血清对MTT 实验方法的影响:酚红是一种pH 中性指示剂,血清是细胞生长必需的营养成份,两者都是细胞培养液的基本成份。酚红在pH7.0, 以上试液中呈紫红色,在570 nm 有较大光吸收值。血清蛋白在有机溶剂中容易变性形成絮状沉淀,影响透光度。（3）异丙醇等用作Formazan 溶剂,无须酸化也能消除酚红的影响: 为了消除酚红对MTT 实验结果的影响,Mosmann (1983) 提出用酸化异丙醇作Formazan 溶剂,酸化异丙醇可将酚红显示的紫红色转变为无色。Francois (1986) 认为酸化异丙醇溶解Formazan 改变了原光谱特性,降低灵敏度,提出改用无酚红的培养基。未经酸化的异丙醇在一定条件下也可以消除酚红的影响。异丙醇等有机溶剂本身为弱酸性 ,能够中和中性和弱碱性试剂,如RPMI21640 (pH7. 3) 。当异丙醇与RPMI - 1640 的溶量比达到1∶1 以上时即可将酚红的紫红色转变成无色。（4）细胞代谢酶存在部位对MTT 实验结果的影响:细胞线粒体产生的琥珀酸脱氢酶是细胞生长代谢产物,这种酶裂解MTT形成Formazan 是MTT实验方法的理论基础。琥珀酸脱氢酶的产生和分布规律与MTT检验方法的灵敏度和稳定性有很大关系（5）MTT使用浓度选择:在不饱和状态下,或是细胞密度一定,MTT 不饱和;或是MTT一定,细胞密度不饱和,Formazan 的生成量分别与MTT浓度和细胞分泌的酶活