肽与蛋白质HPLC分析和纯化手册.doc

第一章 简介：肽和蛋白质的反相HPLC分析与纯化 反相高效液相色谱（RP-HPLC）已经成为一种分析和纯化生物分子广泛而可靠的方法。RP-HPLC在肽、蛋白质分析和纯化方面的重要作用在于它的分离度：RP-HPLC能够分离具有几乎同样序列的多肽，这不仅包括那些胰岛素消化物中的小肽，还包括更大的肽。仅相差一个氨基酸残基的多肽通常可以用RP-HPLC分离，如图1所示的胰岛素变异物的分离。胰岛素变异物的分子量都在5300左右,只是在氨基酸序列上有轻微的不同，即使这样，大部分的变异物都可以用RP-HPLC分离。特别的是，反相色谱能分离人和兔的胰岛素，两者仅在于一个亚甲基的不同——兔胰岛素有一个苏氨酸，而人胰岛素有一个丝氨酸！ RP-HPLC对相近胰岛素变异物的分离 图1.RP-HPLC分离含有一个不同氨基酸的人和兔胰岛素。色谱柱：VYDAC 214TP54 洗脱液：27-30%ACN+0.1%TFA，1.5mL/min，25min。 科学文献中已有很多用RP-HPLC分离相似多肽的例子。含有一个氧化蛋氨酸的胰岛素样生长因子白细胞介素白细胞介素 RP-HPLC用于分离酶消化产物中的肽碎片，纯化天然肽及合成肽。制备RP-HPLC常常用于纯化克及毫克量的合成肽。RP-HPLC能用于分离血红蛋白变体，鉴别微粒种类，研究酶亚基和细胞功能。RP-HPLC还能纯化用于序列测定的微量级肽，并纯化治疗用的毫克级到千克级生物技术衍生多肽。 反相HPLC广泛用于生物制药领域的蛋白质治疗制品的分析。通过分析蛋白质治疗制品的酶消化物能识别蛋白质，并检测基因变化与蛋白质降解（脱酰氨和氧化）产物。用RP-HPLC分析完整蛋白质，能验证蛋白质的结构并测定降解产物。随着生物技术革命的扩展，该色谱技术的应用也随之扩大。在过去的几年中，仅涉及VYDAC反相色谱柱方面的专利数目就已呈现指数级的增长，如图2（又见参考资料74）。 用Grace Vydac反相HPLC色谱柱发表的专利数 图2。美国专利局公布的1984-2000年间在专利中使用VYDAC?反相HPLC色谱柱的专利数。  第二章 多肽与RP-HPLC色谱柱的作用机制 了解多肽与反相表面的作用机制对于理解RP-HPLC的多肽分离很重要。小分子的分离与分子在流动相和疏水性的固定相之间的连续分配有关。但是多肽分子很大，很难分配到疏水相之中；它们进入色谱柱后就吸附到疏水相的表面，直到有机调节剂的浓度达到临界浓度时才会脱附（图3）。脱附后，多肽分子顺着柱子洗脱下来，它们与固定相表面就只有轻微的作用了。 多肽/反相之间相互作用的吸附/脱附模型  图3.流动相中的多肽进入色谱柱。多肽的“疏水脚”吸附到疏水性的反相材料表面，当有机调节剂浓度升到临界浓度时，多肽就脱附下来了。 可以认为多肽是“坐在”固定相上面的，多肽分子的大部分都暴露在流动相中，只有一部分——“疏水脚”——与反相表面接触。RP-HPLC是基于多肽之间“疏水脚”的微小差别来分离多肽的。“疏水脚”的不同源于氨基酸序列的不同与结构的不同。 多肽与疏水相之间吸附/脱附机制的关键 由于脱附多肽所需的有机调节剂分子的数目（Geng和Regnier称之为“Z”值）非常精确，所以脱附只在很狭窄的有机调节剂浓度范围内发生。这使得多肽只有在有机调节剂达到临界浓度时才发生突然脱附，否则它们将全部被保留在色谱柱中（图4）。多肽脱附对精确浓度的敏感性，是分离多肽时RP-HPLC具有选择性的原因。当到达临界浓度时，多肽突然脱附并产生尖峰。“Z”值对蛋白质结构的敏感性和在调节剂临界浓度时的突然脱附，使得RP-HPLC能分离非常相似的多肽（见第2页）。分子保留时间与有机调节剂浓度 图4. A：由于是通过分配而保留，联苯等小分子的保留时间随着有机调节剂浓度的增加而逐渐减少。 B：当有机调节剂浓度达到能脱附多肽的临界浓度时，溶解酵素等多肽的保留时间发生突然而剧烈的变化，证明了多肽—反相表面之间相互作用的吸附/脱附模型。  使多肽能够得以分离的“疏水脚”对分子结构非常敏感。RP-HPLC对蛋白质结构的敏感性，使其不仅能分离疏水脚不同的多肽，还能分离分子中其它地方存在差别的多肽。Kunitani和Johnson发现，由于结构的差异，非常相似的白细胞介素-2突变蛋白也能得到分离，包括存在一个氧化蛋氨酸的差别或单个氨基酸取代基的不同。Geng和Regnier发现，虽然“Z”值与变性蛋白的分子量有关，但是，具有完整三级结构的蛋白质比预想的要早洗脱出来，因为在蛋白质与固定相的相互作用中只涉及到“疏水脚”，蛋白质的其它部分是与流动相接触的。 多肽在色谱柱中的吸附/脱附只发生一次。脱附后，多肽和