胆绿素还原酶在帕金森病小鼠模型中的检测与分析.doc

胆绿素还原酶在帕金森病小鼠模型中的检测与分析 北京市陈经纶中学高三 吴轶凡 学科：分子生物学 摘要： 为了探讨胆绿素还原酶(biliverdin reductase，BVR)与帕金森病的关系，应用蛋白质组学的方法研究了帕金森病模型小鼠黑质和纹状体中胆绿素还原酶表达的变化情况。利用蛋白质免疫印迹及十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳法检测，结果发现帕金森病模型小鼠黑质和纹状体部位胆绿素还原酶的表达增加，提示胆绿素还原酶可能与帕金森病的发生发展相关。 关键词：帕金森病，胆绿素还原酶，蛋白表达，免疫印迹法 1. 引言 1.1 帕金森病 帕金森病(PD)是一种中枢神经系统变性疾病，主要是因为黑质部位多巴胺能神经元病理性改变后多巴胺合成减少，抑制乙酰胆碱能力降低，造成椎体外系运动功能紊乱。主要症状有静止性震颤、肌强直、运动迟缓、姿势反射障碍等。如今，随着老龄化社会的来临，世界帕金森病患者日益增多，现已有约四百万中老年人患该疾病。很多科学工作者正在深入研究帕金森病的发病原因及病理机制，来解决现在只能“治标不治本”的医学现状，并努力寻找多巴胺能神经元发生变性坏死的原因。 目前为止帕金森病的发病机制尚未完全清楚，公认学说之一是氧化应激1。遗传、环境毒素、年龄因素等都能导致氧化应激。该学说认为多巴胺能神经元变性的原因是多巴胺氧化代谢过程中产生大量活性氧物质，进一步产生较大毒性的氧自由基，同时多巴胺能神经元内线粒体呼吸链复合物I活性下降，抗氧化物质消失，无法清除自由基。自由基通过氧化神经膜类脂、破坏多巴胺能神经元膜功能或直接破坏细胞DNA，最终导致神经元变性死亡。 1.2 胆绿素还原酶B 胆绿素还原酶B是本实验室前期蛋白质组学研究发现的一系列可能与帕金森病相关的关键蛋白之一。它是血红素加氧酶的下游酶，能将胆绿素还原为胆红素。具体讲是HOs在NADPH、细胞色素P-450还原酶和氧分子存在的情况下氧化血红素生成一分子胆绿素，一分子一氧化碳以及一分子铁离子，胆绿素在胆绿素还原酶作用下随后很快生成胆红素，但HOs的作用并不仅是分解血红素维持体内的血红素平衡，血红素本身是一种毒性很强的氧化剂，由HOs产生的胆绿素及胆红素均具有抗氧化功能2。这种抗氧化功能结合帕金森病的氧化应激理论提示我们胆绿素还原酶可能在帕金森病的发生发展中起着重要作用。 1.3 MPTP致小鼠帕金森病模型 1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶（MPTP）能够选择性损伤黑质和纹状体的多巴胺能神经元，广泛用于帕金森病动物模型的建立。C57BL/6小鼠在应用较大剂量MPTP后，能够产生与临床病人十分相似的病理、生化改变，是一种常用的帕金森病动物模型，可以用于研究帕金森病的发病机制。MPTP易穿过血脑屏障，在单胺氧化酶B的作用下转化为离子形式的1-甲基-4-苯基吡啶离子（MPP+）。MPP+被多巴胺转运体载入多巴胺能神经元内，逆行转运至胞体和轴突，在线粒体中积聚，抑制线粒体呼吸链复合物I，干扰线粒体呼吸链功能，导致细胞的坏死和凋亡，产生神经毒性3。 2. 研究材料与方法 2.1 材料与试剂 2.1.1 动物 C57BL/6小鼠，雄性，体重20-25 g，由北京大学医学部试验动物中心提供。 2.1.2试剂 1）抗体 Anti-BVRB 多克隆抗体购自Cell Signaling公司； Anti-Actin多克隆抗体、辣根过氧化物酶标记兔抗山羊IgG和辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG均购自Santa Ctuz公司。 2）匀浆液配方4 Tris-HCl (pH 7.4) 80mM 800μL (1M) NaCl 150mM 0.0857g Na2EDTA 2mM 0.007444g SDS 0.1% 1000μL DTT 1mM 0.0015g 蛋白酶抑制剂混合物—protease inhibitor cocktail set 10μL/mL (Merk 公司) 3）上样缓冲液 试剂 浓度 体积 Tris-HCl 60mM 0.6mL1M 甘油 15% 5mL50% SDS 2% 2mL10% 巯基乙醇 14.4mM 0.5mL 溴酚兰 0.1% 1mL1% 蒸馏水 0.9mL 4）制胶——规格：1.0mm厚，单面 试剂 分离胶 浓缩胶 Arc/Bis (丙烯酰胺) 1.87mL 0.23mL H2O 2.96mL 1.25mL TB (Tris-Buffer) (1.5M) 1.67 mL, pH 8.8 0.5mL, pH 6.8 SDS 670μL 20μL TEMED 3.