探讨披覆银之材料使用在体外固定装置於体外环境下之生物相容性及.pptVIP

探討披覆銀之材料使用在體外固定裝置於體外環境下之生物相容性及基因毒性研究 學生：陳聖元 指導教授：郭聰源 報告日期：101年7月13號 大綱 一、研究動機 二、實驗步驟及方法 三、結果 四、討論 五、結論 一、研究動機(1/2) 由於細菌對環境有高適應性，及手術時鄰近組織會有機率受損，所以使用外固定裝置後常發生骨針感染的問題 體外固定裝置(外固定)是使用骨針和線圈的方式，在遠離受傷部位的地方，連結軟骨、骨髓和骨組織進行連鎖固定 使用全身性抗生素不能控制感染，抑制細菌附著和加強組織的生物相容性才能達到抗菌的需要 一、研究動機(2/2) 銀能有效的降低細菌的繁殖能力，進而達到抗菌功能，多年來在醫療方面已有安全、穩定的應用 在材料上包覆上銀，在體內或體外環境都能有效降低細菌繁殖能力和骨針感染 銀擁有毒性(銀質沉著症)，若使用銀薄層和基材鍵結，不僅降低對人體的毒性，同時也不會影響其抗菌功能 本實驗研究包覆銀的不銹鋼用在體外固定骨針上之生物相容性，與最常被使用在外科手術上的未包覆銀的不銹鋼做比較來探討相容性，細胞毒性和細胞基因影響 二、實驗步驟及方法 準備材料 細胞生成試驗 細胞毒性試驗 細胞相容性試驗 統計分析 二、實驗內容-準備材料 1.5cm 0.5cm的AISI 316L 不銹鋼釘 用80kV離子束沉澱汽化的銀形成薄膜 用SPI-ARGENTTM法把銀包覆在不銹鋼上 吸收量6*1017離子/cm2，深度150nm 加工時溫度不超過150°C PS. 1.加工時粗糙度因為與支架相同所以不予標示 2.使用鋼釘前，以160度C持續兩小時進行消毒 二、實驗內容-細胞生成試驗(1/2) 觀察姐妹單染色體交換(SCEs)的次數評估 肝素(從10人取得成3組)、RPMI 1640培養液、30%胎牛血清、10μg/ml植物凝血素、100U/ml青黴素、50U/ml鏈黴素 溫度37度C培養72小時，培養經過24H時，在生成0.25mg/ml秋水仙鹼1小時前加入溴，以防止細胞分裂 經過氯化鉀低壓處理後，使用甲醇3:醋酸1的比例使細胞固化，再以1.5%吉薩姆染液染色觀察 二、實驗內容-細胞生成試驗(2/2) 經過紀錄各個培養中30個分裂的細胞後，每個培養皿中的著絲點都在一個橫向的面上 增植率(PRI)的計算是由細胞的動態分析查看，由誘導有機體突變的物質和致癌物質引起，為(M1+M2+M3)/100的值除以SCEs的頻率 微核試驗使用淋巴細胞的姐妹單染色體交換，在37°C培養72小時，在經過44小時的培養後，加入細胞鬆弛劑(Cyt-B)使濃度達到6mg/ml，以抑制細胞在第一次分裂時胞質細胞和雙核細胞的累積 經過低壓處理(一比一的0.56%氯化鉀和0.9%氯化鈉)後，在室溫下用甲醇和醋酸3:1使細胞凝固，用0.5%Giemsa染色因為其雙細胞核的外觀所以很好辨認 二、實驗內容-細胞毒性試驗(1/2) 為了要得到培養皿中急性細胞毒性的衍生物，所以由乳酸鹽脫氫酶(LDH)的濃度來判斷，由人骨中進行酶隔離取得的單層類成骨細胞來研究 將直徑3-5mm的微粒鋪在90mm的裝有0.2~0.6g的骨頭在每個培養皿中，跟細菌膠原酶放在一起，並除去纖維母組織細胞以及無明顯特徵的成骨細胞 骨細胞外加入10ml的ISCOVE’S培養液、20%的胎牛血清50U/ml的青黴素、15mcg/ml的鏈黴素和2mM的穀胺流胺在37°C，95%空氣和5%二氧化碳下培養 骨細胞使用成骨細胞形貌、鹼性磷酸酶測試和PTH的激素反應測定 二、實驗內容-細胞毒性試驗(2/2) APA反應在成骨細胞的呈現，是使用組織化學性的染色以達到顯像的目的，該樣本使用3%中性福馬林固定30分鐘後，以PBS清洗三次，37°C和bromochloroinoyl phosphere/nitro blue tetrazolium培養 進行量測前，以含有20mM胰蛋白酵素(EDTA)的PBS進行沖洗，40倍率徠卡光學顯微鏡(Leica light microscope)觀察，在錐蟲染料排出試驗中對於類成骨細胞能做到90-95%的再現率 細胞膜被破壞會釋放出浮在培養液表面的LDH，所以可以作為細胞毒性的指標 陰性反應組未加入其它材料，而只進行成骨細胞的培養 陽性反應組加入有害的媒介(采酮0.05%)作為試劑 二、實驗內容-細胞相容性試驗(1/2) 細胞相容性是利用成纖維組織細胞和類成骨細胞的附著增植情況評估 第一次是使用培養6小時的NIH3T3細胞以5*104/cm3的量放在材料上生物化學法測定定量的DNA，培養菌用PBS(1ml中加入0.05%的采酮 )沖洗，再加入10 IU/ml的肝素和0.5ml的核醣核酸酶 在室溫下反應0.5~1小時之後再