基因工程制药.ppt

蛋白质复性影响因素： 变性剂浓度 目标蛋白浓度； pH和离子强度； 氧化还原条件。 还原剂： 二硫苏糖醇、β-巯基乙醇、还原型谷胱甘肽； 氧化剂： 氧化型谷胱甘肽; 碱性下通空气。 （1）一致顺序 1. 启动子的结构对表达效率的影响 第三节 影响外源基因表达效率的因素 TTGACA TATAAT 转录起始位点 17bp 5’ 核糖体结合位点 -35 Box 和 -10 Box （2）-35区与-10区之间的距离：间隔为17bp时，启动子最强。 （3）-35区和-10区的碱基顺序：越接近一致顺序，启动子越强。 5’-TTGACA TATAAT 一致顺序 lac trp ?PL recA tac I tac II 5’-TTTACA TATGTT 5’-TTGACA TTAACT 5’-TTGACA GATACT 5’-TTGATA TATAAT 5’-TTGACA TATAAT 5’-TTGACA TTTAAT -35box -10box （1）SD序列：翻译起始阶段，与核糖体16sRNA的3’端相互作用，正确定位起始密码子。SD序列与AUG的距离影响翻译在很多情况下。SD 序列位于 AUG 之前大约七个碱基处，在此间隔中少一个碱基或多一个碱基，均会导致翻译起始效率不同程度的降低。 2. 翻译起始序列对表达效率的影响 SD 　　　 5’—AGGAGGU——AUG—— 16S rRNA3’ UCCUCCA 起始密码子 5’-UAAGGAGG-3’ 如果是A（T），翻译效率最高； 如果是G（C），效率只有50%或25%。 ② mRNA-rRNA互补区域长短影响基因的翻译 5’-AGGAGGU-3’ ？？？？ 5’-AAGGA-3’ ③ SD序列后面的4个碱基 AUG左侧的三个碱基也有影响 （2）起始密码AUG AUG左侧如果是UAU或CUU时，最为有效； AUG右侧的三个碱基也有影响。 如在?-半乳糖苷酶的mRNA中： 是UUC、UCA或AGG时下降20倍。 1. 转录水平的优化 1）使用强启动子或诱导型启动子 2）强终止子，或将两个终止子串联 3）提高mRNA的稳定性 如：在外源基因的下游插入“重复性基因外回文序列 第四节 提高表达水平常用的方法 2. 翻译水平的优化 （1）优化翻译起始区 ① 起始密码子ATG；② mRNA-rRNA互补区域长短，SD序列距离AUG的距离，及碱基种类；③ 翻译增强子 （2）翻译的终止 ① 三个终止密码子，防止核糖体跳跃；② 终止密码子后的核苷酸类型，如UAAU为大肠杆菌最有效翻译终止序列。 （3）密码子的选择 ① 受体菌中共表达稀有密码子tRNA基因；② 将稀有密码子改为偏爱密码子 大肠杆菌高效表达需要强的启动子和终止子： 外源基因在强启动子的控制下表达，容易发生转录过头现象，即 RNA 聚合酶滑过终止子结构继续转录质粒上邻近的 DNA 序列，形成长短不一的 mRNA 混合物过长转录物的产生在很大程度上会影响外源基因的表达。 对于一些终止作用较弱的终止子，通常可以采用二聚体终止子串联的特殊结构，以增强其转录终止作用。 大肠杆菌格外偏爱使用终止密码子UAA, 当其后连上一个U而形成四联核苷酸的情况下 , 转译终止效率便会得到进一步加强。 第五节 基因工程菌的发酵 下游技术的落后是制约我国生物药物发展的主要瓶颈。所谓下游技术是在构建了稳定高效表达的工程细胞(或菌种)之后,进行大规模细胞培养(或工程菌发酵)、分离纯化、制剂、质量控制等一系列工艺技术。 生物药物下游技术发展缓慢的原因：生物制药下游过程工艺十分复杂，需要较高的技术和先进的设备条件，同时，又无固定模式可以借鉴，主要靠自己实践摸索。 要解决这一问题，只有通过多学科技术合作，增加人力和财力投入,提供先进工艺设备。 1、工业上应用的基因工程菌应具备的条件： 一般条件： 1）菌株最好是分泌型的； 2）发酵产品是高浓度、高转化率和高产率； 3）能利用常用的碳源，并可进行连续发酵； 4）发酵温度适当，发酵所产生热量和需氧量都较低； 5）代谢控制容易进行； 6）菌株是不致病的； 7）重组的DNA稳定，DNA不易再发生重组、突变和质粒脱落。 重要条件： 基因工程菌的稳定性：基因工程菌在传代过程中往往出现质粒不稳定的现象。 1）质粒不稳定分为： （1）分裂不稳定：指工程菌分裂时出现一定比例不含质粒子代菌的现象（下游注意的问题，以下所讲均属此类)。 （2