[14秋]C22 免疫学检测技术的基本原理讲义.ppt

* E花环形成试验 * 磁珠分离法 免疫吸附分离法 流式细胞术 肽—MHC四聚体技术 淋巴细胞及其亚群的分离 * 免疫吸附分离法 加入淋巴 细胞悬液 anti-CD4 anti-CD4 anti-CD4 弃上清 * 磁珠分离法 * 流式细胞术 荧光抗体标记混合细胞 喷嘴 单细胞悬液 5000-10000个/秒 细胞分选器 荧光 检测器 * 二、免疫细胞功能的测定 T细胞功能测定 B细胞功能测定 细胞因子检测 T细胞增殖试验 迟发型超敏反应的检测 抗体含量测定 溶血空斑试验 巨噬细胞吞噬试验 细胞毒试验 吞噬功能测定 51Cr释放法 乳酸脱氢酶释放法 细胞染色法 凋亡细胞检测法 硝基蓝四氮唑试验 生物活性检测法 免疫学检测法 * T细胞功能测定 T细胞增殖试验 迟发型超敏反应的检测 T细胞受到特异性抗原或有丝分裂原刺激后发生增殖，可通过以下三种方法检测： 形态计数法：活化细胞体积增大、形态不规则、胞质增多、细胞核松散及出现较多核仁； 3H-TdR或125I-UdR掺入法：3H-TdR能掺入到合成的DNA中，用液体闪烁仪检测样品的放射活性，特点是灵敏可靠，但须特殊仪器，易有放射性污染。 MTT (四甲基偶氮唑盐)比色法： 外来抗原刺激机体产生免疫应答后，再用相同的抗原作皮试，可导致迟发型超敏反应，T细胞活化并释放多种细胞因子，产生以单个核细胞浸润为主的炎症，局部发生充血渗出，24-48h发生，72h到达高峰。阳性反应表现为局部红肿和硬结，反应强烈的发生水肿甚至坏死。细胞免疫正常者出现阳性反应，细胞免疫低下者呈弱阳性或阴性反应。常用于检测某些微生物感染、免疫缺陷病、肿瘤患者免疫功能测定。 * B细胞功能测定 抗体含量测定 溶血空斑试验 可通过单项琼脂扩散法、ELISA、速率比浊法等测定标本中各类Ig的含量。 绵羊红细胞(SRBC)免疫动物 4天后取出动物脾脏，在脾细胞悬液中含有抗SRBC的浆细胞 脾细胞与SRBC在适量琼脂糖液中混匀 在抗体形成细胞周围出现溶解的透明区，即溶血空斑。1个空斑区代表1个浆细胞 通过记录溶血空斑的数目可知抗原特异性B细胞的数目 加入新鲜补体，倒入平皿中培养 * 复习题 体外抗原抗体结合反应的特点。 定义 凝集反应 沉淀反应 检测抗原或抗体的试验方法有哪些？ 免疫细胞功能检测的方法？ * L/O/G/O * * 免疫学检测技术的基本原理 体外抗原抗体结合反应的特点及影响因素 体内：抗原+抗体→免疫反应 体外：抗原+抗体→进行检测 检测抗原或抗体的体外实验(血清学实验） 凝集反应 沉淀反应 免疫标记技术 蛋白质芯片技术 免疫细胞功能的检测 * 第一节 体外抗原抗体反应的特点及影响因素 （一）抗原抗体反应的特点 1. 高度特异性 2. 表面化学基团之间的可逆结合（可逆性） 3. 适宜的抗原抗体浓度和比例（比例性） 4.抗原抗体反应的两个阶段 ①抗原抗体特异性结合阶段 ②可见反应阶段 * 1.高度特异性 抗原抗体反应物质基础是抗原表位(决定簇)与抗体CDR的互补结合(相互吻合，具有互补性)。 * 抗原和抗体的结合是互补性的特异性结合。通过非共价键结合。 2.表面化学基团之间的可逆结合（可逆性） * Ab Ag Ab Ag 特异性 结合力的表示方法 亲和力和亲合力 低亲合力 高亲合力 Ag-Ab结合的力 亲和力 亲合力 低亲和力 高亲和力 * 3.适宜的抗原抗体浓度和比例（比例性） * （二）抗原抗体反应的影响因素 1.电解质 0.85%氯化钠或各种缓冲液 2 .温度 37℃ 56℃ 3 .酸碱度 最适pH值在6-8之间 * 第二节 检测抗原或抗体的体外试验 * 定义：颗粒性抗原(细菌、细胞等或表面包被抗原的颗粒)与相应的抗体在电解质存在的条件下结合，出现肉眼可见的凝集团块现象。 一、凝集反应（agglutination reactions) * 包括： 1.直接凝集反应 (direct agglunitation reatctions) 玻片法：ABO血型鉴定、细菌鉴定 试管法：抗体效价的判定 2.间接凝集反应 (indirect agglunitation reactions) * 直接凝集反应 1:2稀释待测血清 1:4 1:8 1: