HITS-CLIP步骤.docVIP

第一天： 细胞培养在100或150mm的平板上，用PBS漂洗，然后place in Stratalinker with the cover off。以400mJ/cm2照射一次和additional 200 mJ/cm2 in Stratalinker。 收集细胞悬液，4℃下2500rpm离心细胞团5min，3(~3x dry volume)倍细胞沉淀体积的PBS重悬细胞团，每个eppie加入1ml的细胞悬液，在4℃下快速离心，去上清，然后保存在-80℃备用（每管大约200μl细胞）。 备注： 1×HBSS： 50ml 10×Hank’sCa-Mg-free(Gibco, #14186-012) 5ml 1M HEPES, pH7.3 445ml ddH2O 第二天： II．免疫沉淀 溶液（现用现配） 1×PXL （wash buffer） 1× PBS（组织培养等级tissue culture grade；不含Mg2+，Ca2+） 0.1% SDS 0.5% 脱氧胆酸盐 0.5% NP-40 5×PXL （高盐wash buffer） 5× PBS（组织培养等级；不含Mg2+，Ca2+） 0.1% SDS 0.5% 脱氧胆酸盐 0.5% NP-40 1×PNK缓冲液 50 mM Tris-Cl pH 7.4 10 mM MgCl2 0.5% NP-40 1X PNK+EGTA Buffer 50 mM Tris-Cl pH 7.4 20 mM EGTA 0.5% NP-40 Bead的制备： 每一Eppie的交联裂解液使用400 μl的蛋白A免疫磁珠(Dynal, 100.02) 用pH 8.0的0.1 M的磷酸钠溶液洗小珠三次。（这里使用高pH是因为能增加蛋白A对抗体的结合。然而这需要所有免疫沉淀的缓冲液应该适用于你所用的抗体。例如，我们发现有些抗体在缓冲液中不与脱氧胆酸盐作用。） 用350μl的pH 8.0的0.1 M磷酸钠重悬小珠，加入50 μl桥联Ab（2.4mg/ml；兔抗鼠IgG）。 在室温旋转试管45min；用pH 8.0的0.1 M磷酸钠洗三次。 在400 μl pH 8.1的0.1 M磷酸钠溶液中重悬小珠，加入3 μl的2A8或12 μl的7G1-1*ascite液体（5mg/ml）。 4°C下旋转试管4小时，1×PXL洗三次；如果你不准备加入交联裂解液，在最后一步移去小珠leave beads in last wash step。 RL3 (-P)接头（不含P磷）对5’末端的标记。 （在做IP之前或过程中制备5’末端标记的接头。用预标记的3’接头做AGO HITS-CLIP，发现在放射自显影图中比免疫沉淀后PNK反应标记分离得到的RNA有更多特异性信号。） 2.4 μl RL3(-P)接头(50pmol/μl；5’端不含磷酸) 5 μl 10×PNK Buffer(NEB) 25 μl 32P-γ-ATP 8 μl T4 PNK enzyme (NEB, M0201L) 3 μl RNA酶 (Promega) 6.6 μl water 50 μl total 37°C时用Thermomixer R (Eppendorf)孵育30min。 加入0.2μl的10mM的ATP，继续反应5min。 旋转使树脂重悬在G-25柱子中。 事先以735g离心柱子1min，使样品混入树脂，735g旋转柱子2min。如果不打算立即使用，可以置于-20°C保存。 RNA的部分消化以及超速离心 用700 μl 1×PXL（含蛋白酶抑制剂；总体积为1ml）重悬每管的交联裂解液；加入15μl的RNA酶(Promega)，置于冰上10min。 每管加入30μl的RQ1 DNA酶，37°C孵育5min 1000rpm。 在1×PXL中以1:100稀释RNA酶（高浓度RNA酶） 在1×PXL中以1:1000稀释RNA酶（低浓度RNA酶） 往两只试管中分别加入两种浓度的RNA酶10μl；37°C孵育5min。 30K for 20min at 4°C超速微量离心(polycarbonate tubes in TLA 120.2 rotor)裂解液。 小心去上清，留下10μl做immunoblot实验。 免疫沉淀 把剩余的上清加入另一只新的含有bead的试管中。4°C旋转beads/裂解液混合物2-4小时。 去上清，留下10μl做immunoblot实验（以确定抗原