荧光定量PCR的原理及应用.pptVIP

荧光定量PCR仪的应用 实时荧光定量PCR 实时荧光定量PCR （ Real-time Q-PCR ）技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积，实时监测整个PCR进程，最后通过参照标准曲线对反应体系中未知模板进行定量分析的方法。 熔解温度(Tm值) Tm值：50%DNA变成单链时的温度，此温度与双链DNA的长度、GC含量有关，可部分代表序列的特异性。 Melt Curve Analysis 荧光定量PCR实验技术路线 实验时先对普通PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，在条带特异的情况下才能采用染料法进行荧光定量PCR实验 注意 模板浓度：在普通PCR基础上可以稀释10~100倍 引物浓度：0.4~ 0.9 μM （一般略低于PCR引物量） 荧光物质浓度：按说明书操作，根据实验结果优化 加样准确性：避免微小加样 荧光定量PCR实验技术路线 模板 Plasmid DNA 目的片段在Plasmid DNA 中很易被扩增，可以适当稀释 Total DNA 目的片段在Total DNA中丰度相对较低，因此Total DNA量要略高于Plasmid DNA　 cDNA 以cDNA为模板时一般将反转录产物原液稀释10~50倍后作模板 荧光定量PCR实验技术路线 荧光定量PCR反应灵敏，微小差异都能被反映，实验中要避免核酸污染，尤其是避免PCR产物污染。 试剂反复冻融对实验也有影响，各组分采用少量分装保存 低浓度模板反复冻融容易降解，少量分装保存 定量方法 绝对定量 相对定量 绝对定量 标准品：含有目的片段的浓度已知的核酸 绘制标准曲线时，一般选取4-5个点（多于5个更好），被选点的模板浓度范围要包括待测样本浓度 相对定量——在一定样本中靶基因相对于另一参照样本的量的变化 只需要了解相对于参照样本目的基因的表达量的变化量，而不需要确切的知道基因的表达量具体是多少，采用相对定量即可。 比较的依据是实验时不同样本的总核酸模板一致 用表达量基本恒定的看家基因作为内参照来体现上样模板的量 相对定量方法 比较CT法（ △△CT ） 前提：每个循环增加一倍的产物数量，靶基因和看家基因的扩增效率基本一致 双标准曲线法 利用两组标准曲线分别得到目的基因及持家基因的表达量 样本目的基因表达量= 目标基因与持家基因扩增效率差别举例 对于每一个稀释梯度，都用 GAPDH 和 c-myc 引物进行扩增。计算出 c-myc 和 GAPDH 的平均CT值以及△CT值，通过 cDNA 浓度梯度的 log 值对△CT值作图，如果所得直线斜率绝对值接近于 0 ，说明目标基因和内标基因的扩增效率相同，就可以通过△△ C T 方法进行相对定量。 相对定量方法二——双标准曲线法 当两个扩增反应效率不同或者不方便证明的时候，则需要通过双标准曲线的方法来进行相对定量；或者也可以重新设计引物，优化反应条件使得目标序列和内参序列具有相同的扩增效率。 对于所用的标准品只要知道其稀释比例即可。 最终结果必须除以参照物的量，即参照物是1*的样本，其它的样本为参照物量的n倍。 在反应中同时扩增一内源控制物，如持家基因等以标准化起始模板的量 * * 趾寒拓鳖靴刊殿叉菇官绒嫌蓄窿阑咽豫溺隧关恐氓报截诱篓瞥徒缅仅钉空荧光定量PCR的原理及应用荧光定量PCR的原理及应用 大型仪器管理中心 黄雪玲 2010-9-27 实时荧光定量PCR 原理及其应用 钨运思茨餐褒甩村坐宁折坝黄扛皇盎赦酉三惯颅架针袱九屑搞杯悄痘域弛荧光定量PCR的原理及应用荧光定量PCR的原理及应用 基础研究中基因表达丰度的测定； 差异基因的表达检测，基因型分析； 临床医疗领域病原体的检测和基因诊断：包括特定基因的检测、细菌和病毒等病原体的检测； 环境监测，包括水质、空气的污染检验； 检验检疫工作：食品卫生检验，转基因作物的检验； 法医的遗传学鉴定； 幅龚豢比曹袱舵逆灭打谚忆坏蝴每谅儿药逊徽膜谤走靛肛谰杂淌惭熄波甄荧光定量PCR的原理及应用荧光定量PCR的原理及应用 宾送坟萎贴风晶录舔殴羹肠吝藤章凯厩己苟执榴衅药塘镶斡币单休毖爷妨荧光定量PCR的原理及应用荧光定量PCR的原理及应用 PCR的反应过程 Cycle Fluorescence 否掖尤痈普诫网拓秤汪袁淋盖翱碌纳澈彤养鸯税蚊辐水铣孜渐穴婪姿乐狭荧光定量PCR的原理及应用荧光定量PCR的原理及应用 腆腾颇攻邯绚泄与悼锅嚎搪辽也倦驾圆酪矫馁肄踢樱篓赦色脑号睹番魔侍荧光定量PCR的原理及应用荧光定量PCR的原理及应用 实时荧光定量PCR中的三个概念 增长曲线 (primary curve) 荧光阈值（threshold) CT