蛋白质的分离纯化和表征.docVIP

第七章 蛋白质的分离纯化和表征 第一节 蛋白质的酸碱性质 各个解离基团的pK 值与游离氨基酸的不完全相同。 等电点要用等电聚焦等方法测定。 第二节 蛋白质分子的大小与形状 一、根据化学组成测定最低相对分子质量 假定某种微量成分只有一个，测出其百分含量后，可用比例式算出最低相对分子质量。 若测出两种微量成分的百分含量，分别用比例式算出的最低相对分子质量不相同时，可计算两个最低相对分子质量近似的最小公倍数。 例题：一种纯酶含亮氨酸（Mr 131）1.65%，含异亮氨酸（Mr131）2.48%，求最低相对分子质量。 解：按照Leu 的百分含量计算，最低Mr X1： X1=(100′ 131)/1.65=7939.4。 按照Ile 的百分含量计算最低Mr X2： X2=(100′ 131)/2.48=5282.3。 由于X1 和X2 数字差异较大，提示这种酶含Leu 和Ile 不止1 个，为了估算Leu 和Ile 的个数，首先计算： X1/X2=7939.4/5282.3≈1.5。 这种酶含任何氨基酸的个数均应是整数，说明该酶至少含有2 个Leu，3 个Ile，其最低相对分子质量为： 7939.4 ′2 =15878.8 或5282.3×3=15846.9。 二、渗透压法测定相对分子质量 三、沉降分析法测定相对分子质量 基本原理： （一）离心力(centrifugal force，Fc) 当一个粒子（生物大分子或细胞器）在高速旋转下受到离心力作用时，此离心力“Fc”由下式定义： F=m·a=m·ω2 r a—粒子旋转的加速度，m—沉降粒子的有效质量，ω—粒子旋转的角速度，r—粒子的旋转半径(cm)。 （二）相对离心力(relative centrifugal force，RCF) 由于各种离心机转子的半径或者离心管至旋转轴中心的距离不同，离心力而受变化，因此在文献中常用“相对离心力”或“数字×g”表示离心力，只要RCF 值不变，一个样品可以在不同的离心机上获得相同的结果。 RCF 就是实际离心场转化为重力加速度的倍数。 X 为离心转子的半径距离，以cm 为单位；g 为地球重力加速度（980cm/sec2）；n 为转子每分钟的转数（revolutions per minute，简写成r/min，或rpm）。 （三）沉降系数(sedimentation coefficient，s) 根据1924 年Svedberg 对沉降系数下的定义，颗粒在单位离心力场中粒子移动的速度。 X1：离心前粒子离旋转轴的距离；X2：离心后粒子离旋转轴的距离。S：时常在10-13秒左右，故把沉降系数10-13秒称为一个Svedberg 单位，简写S，量纲为秒。 例如，动物原生质核糖体的沉降系数等于80S，它的含义就是：80×10-13s。细胞及细胞的各组分的沉降系数有很大的差异，所以可以利用生物样品沉降系数的差异采用离心技术将他们彼此分开。 （四）沉降速度(sedimentation velocity) 对于球形颗粒： Fc=1/6Πd3(ρp?ρm)ω2X；Ff=3Πηdv 当Fc=Ff时，1/6Πd3(ρp?ρm)ω2X=3Πηdv。 v=(1/18η)[d2(ρp?ρm)ω2X] （五）沉降系数与物质相对分子质量 由沉降系数根据Svedberg 公式可以计算出物质的相对分子质量： Mr=RTS20，W/[D20，W(1-γρ)] Mr：相对分子质量；D20，W：以20℃的水为介质时颗粒的扩散系数；R：气体常数；T：绝对温度； S20，W：以20℃的水为介质时颗粒的沉降系数；γ：偏比容，等于溶质粒子密度的倒数；ρ：溶剂密度。 （六）沉降时间（sedimentation time，Ts） 在实际工作中，常常遇到要求在已有的离心机上把某一种溶质从溶液中全部沉降分离出来的问题，这 就必须首先知道用多大转速与多长时间可达到目的。如果转速已知，则需解决沉降时间来确定分离某粒子 所需的时间。根据沉降系数（S）式可得 X2：离心转轴至离心管底内壁的距离；X1：离心转轴至样品溶液面之间的距离，那么（t2－t1）用Ts表示： （七）K 系数(k factor) K 系数是用来描述在一个转子中，将粒子沉降下来的效率。也就是使溶液澄清的一个指数，所以也叫“cleaning factor”。原则上，K 系数愈小将粒子沉降得速度愈快。 由其公式可知，K 系数与离心转速及粒子沉降的路径有关。所以K 系数是一个变数。 通常，离心机的转子说明书中提供的K 系数，都是根据最大路径及在最大转速下所计算出来的数值。 利用此公式预估的离心时间，对水平式转子最适合；对固定角式转子而言，实际时间将比预估的时间来得快些。 四、凝胶过滤法测定相对分子质量 当含有各种组