【2017年整理】基因工程实验教学教案.docVIP

基因工程实验 教学方案 湖南人文科技学院生命科学系 生物技术教研室 实验一 重组质粒的提取及转化表达型菌株 Ⅰ质粒DNA的提取 实验目的 通过本实验学习和掌握碱裂解法提取质粒的技术与方法。 实验原理 1．碱变性法基本原理是，在Ph12.0-12.6碱性环境中，线性的大分子量细菌染色体DNA变性，而共价闭环质粒DNA仍为自然状态。将PH调至中性并有高盐浓度存在的条件下，染色体DNA之间交联形成不溶性网状结构大部分DNA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀，而质粒DNA仍为可溶状态，通过离心可除去大部分细胞碎片，染色体DNA，RNA及蛋白质，质粒DNA尚在上清中，再用酚氯仿或硅基质膜柱子进一步纯化DNA。 2．设计构建体外重组DNA分子 构建体外重组DNA分子，首先要了解目的基因的酶切图谱。选用的限制性内切酶不能在目的基因内部有识别位点，也就是说用一种或两种限制性内切酶就能切割得到完整的外源DNA基因。构建体外重组DNA分子，最简单的重组方式就是在目的基因DNA的两端用两种不同的限制性内切酶进行酶解，产生两个不同的粘性末端。再用这两种限制性内切酶去选择合适的载体进行酶切，也产生这两个不同的粘性末端，这样构建的重组DNA分子，目的基因DNA片段是从一个方向插入质粒载体中的，重组的效率高，也易于筛选处重组子。 附表达载体pGEX-6P-1-mreB的构建图： 仪器材料与试剂 （一）仪器 1．恒温摇床 2．台式离心机 3．漩涡混合仪 （二）材料与试剂 1．含pGEX-6P-1-mreB质粒的大肠杆菌DH5α 2． 含pGEX-6P-1质粒的大肠杆菌DH5α 3．液体LB培养基 4．100mg/mL氨苄青霉素Amp 5．新捷质粒提取试剂盒 实验步骤 分为两组：一组提取质粒pGEX-6P-1-mreB，另一组提取质粒pGEX-6P-1。 1）12000rmp 离心30秒收集1-5ml过夜培养的细菌，弃尽培养基。加入250ul已加入Rnase A的Buffer Ⅰ, 充分悬浮细菌沉淀。 2）加入250ul Buffer Ⅱ, 温和并充分地翻转离心管4-6次。 3）加入350ul Buffer Ⅲ,温和并充分地翻转离心管4-6次。 4）13000 rmp 离心10分钟。 5）将核酸纯化柱置于2ml 离心管中，转移步骤4中的上清液到核酸纯化柱中，盖上管盖，12000rmp离心30秒。 6）弃2ml 离心管中的滤液，将核酸纯化柱置回到2ml离心管中，在核酸纯化柱中加入700ul Buffer W2,盖上管盖，12000rmp离心30秒。 7）弃2ml离心管中的滤液，将核酸纯化住置回到2ml离心管中，14000 rmp离心1分钟。 8）弃2ml离心管，将核酸纯化住置于一个洁净的1.5ml离心管中，在纯化柱的膜中央加入50-100ul Buffer TE ,盖上管盖，室温静置1分钟，12000rmp离心30秒。 9）弃纯化柱，洗脱的质粒可立即用于各种生物学实验，或储存于-20℃。 实验结果 实验安排 3个小时 Ⅱ 质粒DNA的转化 实验目的 通过本实验，掌握大肠杆菌转化的方法与技术。 实验原理 细菌处于容易吸收外源DNA的状态称感受态。转化是指质粒DNA或以其为载体构建的重组子导入细菌的过程。其原理是细菌处于0℃、CaCl2低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形。转化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸DNA复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间热击处理，促进细胞吸收DNA复合物。将细胞放置在非选择性培养基中保温一段时间，促使在转化过程中获得的新的表型（如Ampr等）得到表达，然后将此细胞培养物涂在选择性培养基上。 E.coli DH5α是一种用于质粒克隆的菌株。 E.coli BL21是一种适合于外源蛋白表达的菌株，其内源性的蛋白酶基因缺失E.coli中表达。先让宿主菌生长，lacI产生的阻遏蛋白与lac操纵基因结合，从而不能进行外源基因的转录及表达，此时宿主菌正常生长。然后向培养基中加入lac操纵子的诱导物IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷Tac启动子：Tac启动子是一组由Lac和trp启动子人工构建的杂合启动子，受Lac阻遏蛋白的负调节，它的启动能力比Lac和trp都强。其中Tac 1是由Trp启动子的－35区加上一个合成的46 bp DNA片段(包括Pribnow 盒)和Lac操纵基因构成，Tac 12是由Trp的启动子-35区和Lac启动子的-10区，加上Lac操纵子中的操纵基因部分和SD序列融合而成。Tac启动子受IPTG的诱导。 仪器材料和试剂 仪器