实验一 物染色体压片技1.docVIP

实验染色体压片技术、 材料的制备： 黑麦根尖(2n=14) 根尖材料的制备： 浸泡：大、油、壳 ( 浸泡24h(23~25℃)；小、裸的不浸泡。 2. 发根：将材料放入具有团粒结构条件的土壤中培养（锯木屑、土壤、砾石、麦杆、谷草)；最适温度(23~32℃)；培养24h(再放入0~4℃冰处理1~7天。目的:(1)使分裂速度减慢，根尖长度整齐一致；(2)调节工作时间。再将材料从冰箱中取出又放回最适温度条件下培养1~2天；待根尖长度为1.5~2Cm即可处理。 3. 愈伤材料的制备：(适合春、夏两季)用刀片将树杆割去保护组织露出伤口，用75﹪乙醇消毒包裹一天，再用50~75ppm赤霉素处理；几天后长出白色幼嫩的愈伤组织即可固定。 、预处理： 1. 方法：(化学和物理两种) (1) 化学方法：(适合所有生物) a. 秋水仙素0.05~0.2﹪ (白色粉末，易溶于水的巨毒药品)b. 0.002M 8-羟基喹啉 (淡黄色晶体，用少量的乙醇溶解再稀释对禾本科植物的随体表现很清楚)C.а-溴萘饱和液 (淡黄色的乳浊液，易溶于乙醇和苯；难溶于水100ml水中倒入1~2滴剧烈的振动5分钟) （以上abc三种药剂在15~18℃温度下处理3~5h）d. 对二氯苯饱和液 (淡黄色的晶体，难溶于水；具有强烈的腐蚀性，只能处理1~1.5h)。 (2) 物理方法：(适合禾本科作物 冰水混合物在0~4℃温度下处理24h。 预处理的目的 破坏或抑制纺锤体形成；增加中期图象，改变细胞质的粘度，使染色体缩短变粗，易于染色体的显带及研究。 、固定： 卡诺氏Ⅰ 3︰1 (乙醇 ︰ 醋酸); 卡诺氏Ⅱ 6︰3︰1 （5︰3︰2）(乙醇︰ 氯仿︰ 醋酸); 固定的目的 利用药剂迅速杀死正在分裂的细胞，使之保持细胞中的染色体处于被固定前的原有状态。 、保存： 冲洗置换，从95﹪~70﹪的乙醇梯度置换；每次置换需停留20~30min,—C带技术 实验原理： 染色体显带技术是借助于特殊的处理程序，使染色体显现出深浅不同的染色带。染色带的数目、部位、宽窄与浓淡具有相对的稳定性。从而在以往染色体形态特征（长度、着丝粒位置、臂比、随体等） 以外又增添了一类新的标志。染色体分带技术能有效地鉴别染色体，研究染色体的结构与功能。 C一带是植物吉姆萨分带的一种类型，是染色体经过C一带程序处理，使染色体着丝粒两侧出现带纹，故名C一带。 二、实验目的： 掌握植物染色体吉姆萨分带技术和方法。 三、实验步骤： 1、制片：选取前两次实验(压片法、去壁低渗法)制备的片子各10张。 2、干燥：两种方法 ⑴自然干燥 松树、洋葱15天，(不超过3过月)；禾本科作物2—15天。⑵无水乙醇干燥 只需要1—12小时即可。(目的：①染色体具有后熟的作用；②去除染色体上的蛋白质；③使材料凝固在片子上)。本实验采用自然干燥方法。 3、酸处理：两种方法 ⑴用45%醋酸在时温下处理1—1.5 h；⑵用0.2MHCl，在时温下处理1—1.5 h， 或25℃下处理10—12min；（处理完毕用，用30℃的蒸馏水过一次）作用：①去除制片上的杂质和染色体上的蛋白质；②破坏细胞质；③使第一次染色褪色。④与染色体上的DNA或某些减基结合，使染色体上不同程度减基脱落，有助于程度不同的显带。应选用⑵种方法。(酸处理是变性的过程。应注意控制时间，如果处理恰倒好处感觉染色体饱满，带纹丰富；如果处理不够，染色体上的色差不明显，观察不到带纹；如果处理过度，染色体很薄，带纹也不丰富)。 4、减处理：两种方法 ⑴强减NaOH、KOH；室温处理，不得超过20秒；(大约15秒) ⑵弱减 Ba(OH)2饱和溶液，在25℃下处理10-12min。减处理也是使染色体变性的过程，作用是与染色体上的DNA减基结合，消化DNA。处理完毕不能直接倒去减液，以防止Ba(OH)2与空气中CO2结合生成的碳酸钡薄膜覆盖在制片材料的表面，影响后续工作的正常进行，所以必须用流动的自来水冲洗，以去除表面的薄膜以及水中的沉淀物,冲洗完毕用30℃蒸馏水漂洗浸泡几分钟，置换出减液。 5、盐处理：用2×SSC盐溶液(0.3MNaCl+0.03MNaC6H5O7 2H2O)，在60℃下处理1.5h。盐处理是使染色体复性的过程，作用(1)调节PH值；(2)修饰DNA上的减性基团和酸性基团。1.5h后倒去盐溶液，加入30℃蒸馏水浸泡几分钟，置换出盐溶液。 6、染色：取吉姆萨母液(1％浓度)10-15ml,用磷酸缓冲液(PH6.8-7.2)稀释至1000ml（比较新鲜的母液15ml,氧化1年以上的母液10ml）