食物中维生素A和维生素E的测定方法.docVIP

食物中维生素A和维生素E的测定方法 1　主题内容与适用范围　　本标准规定了用高效液相色谱法测定食物中维生素A和维生素E。　　本标准适用于食物中维生素A和维生素E的测定。　　第一篇　高效液相色谱法　　2　原理　　样品中的维生素A及维生素E经皂化提取处理后，将其从不可皂化部分提取至有机溶剂中。用高效液相色谱法C18反相柱将维生素A和维生素E分离，经紫外检测器检测，并用内标法定量测定。最小检出量分别为VA：0.8ng；α－E：91.8ng；γ－E：36.6ng；δ－E：20.6ng。　　3　试剂　　实验用水为蒸馏水。试剂不加说明为分析纯。　　3.1　无水乙醚：不含有过氧化物。　　3.1.1　过氧化物检查方法：用5mL乙醚加1mL 10%碘化钾溶液，振摇1min，如有过氧化物则放出游离碘，水层呈黄色或加4滴0.5%淀粉液，水层呈蓝色。该乙醚需处理后使用。　　3.1.2　去除过氧化物的方法：重蒸乙醚时，瓶中放入纯铁丝或铁末少许。弃去10%初馏液和10%残馏液。　　3.2　无水乙醇：不得含有醛类物质。　　3.2.1　检查方法：取2mL银氨溶液于试管中，加入少量乙醇，摇匀，再加入10%氢氧化钠溶液，加热，放置冷却后，若有银镜反应则表示乙醇中有醛。　　3.2.2　脱醛方法：取2g硝酸银溶于少量水中。取4g氢氧化钠溶于温乙醇中。将两者倾入1L乙醇中，振摇后，放置暗处两天(不时摇动，促进反应)，经过滤，置蒸馏瓶中蒸馏，弃去初蒸出的50mL。当乙醇中含醛较多时，硝酸银用量适当增加。　　3.3　无水硫酸钠。　　3.4　甲醇：重蒸后使用。　　3.5　重蒸水：水中加少量高锰酸钾，临用前蒸馏。　　3.6　10%抗坏血酸溶液(m/V)：临用前配制。　　3.7　1∶1氢氧化钾溶液。　　3.8　10%氢氧化钠溶液(m/V)。　　3.9　5%硝酸银溶液(m/V)。　　3.10　银氨溶液：加氨水至5%硝酸银溶液中，直至生成的沉淀重新溶解为止，再加10%氢氧化钠溶液数滴，如发生沉淀，再加氨水直至溶解。　　3.11　维生素A标准液：视黄醇(纯度85%)或视黄醇乙酸酯(纯度90%)经皂化处理后使用。用脱醛乙醇溶解维生素A标准品，使其浓度大约为1mL相当于1mg视黄醇。临用前用紫外分光光度法标定其准确浓度。　　3.12　维生素E标准液：α－生育酚(纯度95%)，γ－生育酚(纯度95%)，δ－生育酚(纯度95%)。用脱醛乙醇分别溶解以上三种维生素E标准品，使其浓度大约为1mL相当于1mg。临用前用紫外分光光度法分别标定此三种维生素E的准确浓度。　　3.13　内标溶液：称取苯并〔e〕芘(纯度98%)，用脱醛乙醇配制成每1mL相当于10μg苯并〔e〕芘的内标溶液。　　3.14　pH1～14试纸。　　4　仪器和设备　　4.1　实验室常用设备。　　4.2　高压液相色谱仪带紫外分光检测器。　　4.3　旋转蒸发器。　　4.4　高速离心机　　4.4.1　小离心管：具塑料盖1.5～3.0mL塑料离心管(与高速离心机配套)。　　4.5　高纯氮气。　　4.6　恒温水浴锅。　　4.7　紫外分光光度计。　　5　操作步骤　　5.1　样品处理　　5.1.1　皂化　　称取1～10g样品(含维生素A约3μg，维生素E各异构体约为40μg)于皂化瓶中，加30mL无水乙醇，进行搅拌，直到颗粒物分散均匀为止。加5mL 10%抗坏血酸，苯并〔e〕芘标准液2.00mL，混匀。加10mL1：1氢氧化钾，混匀。于沸水浴上回流30min使皂化完全。皂化后立即放入冰水中冷却。　　5.1.2　提取　　5.1.2.1　将皂化后的样品移入分液漏斗中，用50mL水分2～3次洗皂化瓶，洗液并入分液漏斗中。用约100mL乙醚分两次洗皂化瓶及其残渣，乙醚液并入分液漏斗中。如有残渣，可将此液通过有少许脱脂棉的漏斗滤入分液漏斗。轻轻振摇分液漏斗2min，静置分层，弃去水层。　　5.1.3　洗涤　　5.1.3.1　用约50mL水洗分液漏斗中的乙醚层，用pH试纸检验直至水层不显碱性(最初水洗轻摇，逐次振摇强度可增加)。　　5.1.4　浓缩　　5.1.4.1　将乙醚提取液经过无水硫酸钠(约5g)滤入与旋转蒸发器配套的250～300mL球形蒸发瓶内，用约10mL乙醚冲洗分液漏斗及无水硫酸钠3次，并入蒸发瓶内，并将其接至旋转蒸发器上，于55℃水浴中减压蒸馏并回收乙醚，待瓶中剩下约2mL乙醚时，取下蒸发瓶，立即用氮气吹掉乙醚。立即加入2.00mL乙醇，充分混合，溶解提取物。　　5.1.5　将乙醇液移入一小塑料离心管中(4.4.1)，离心5min(5000rpm)。上清液供色谱分析。如果样品中维生素含量过少，可用氮气将乙醇液吹干后，再用乙醇重新定容。并记下体积比。