饲料防霉剂防霉效果判定的三种便捷的方法.docVIP

饲料防霉剂防霉效果判定的三种便捷的方法 韩康印，欧阳亮，黄海珊 韩康印，上海邦成生物科技有限公司，201615，上海市。单位及通讯地址同第一作者、饲料常规试验、饲料破坏试验 电子天平：型号JA1003，上海瞬宇恒平科学仪器有限公司 移液枪：100—1000ul 培养皿 牛津杯：不锈钢管，外径（7.8±0.1mm），内径（6.0±0.1mm），高度（10±0.1mm） 抑菌圈自动测量分析仪或游标卡尺（精确到0.1mm） 1.3实验方法 平皿抑菌计数法[4] 本法根据霉菌生理特性和防霉剂防霉原理，选择适宜霉菌生长而不适宜细菌生长的高盐查氏培养基，灭菌后趁热倾注20 ml培养基至培养皿内，待培养基凝固后。将菌液稀释至每毫升含霉菌约100个，将稀释后的霉菌菌液与0.08g/ml的防霉剂样品液按1:1混合后，取1ml混合液至固体培养基中间，均匀涂布，使防霉剂相对于培养基的浓度为0.2%，待干后，将培养皿翻转，置于霉菌培养箱内，在28℃下培养观察霉菌菌落总数。以同体积的无菌水代替防霉剂样品液与霉菌菌液混合的混合液作为空白对照。 每组设置三个平行，28℃培养两天。 分别以0.10g/ml、0.12g/ml的防霉剂样品代替0.08g/ml防霉剂样品做重复实验，使防霉剂相对于培养基的浓度为0.25%、0.3%。 表一 固体培养基中防霉剂样品添加量 样品 0.08g/ml丙酸钙 0.08g/ml双丙酸铵 0.1g/ml丙酸钙 0.1g/ml双丙酸铵 0.1g/ml丙酸钙 0.12g/ml双丙酸铵 丙酸钙0.2% 1ml 0 0 0 0 0 双丙酸铵0.2% 0 1ml 0 0 0 0 丙酸钙0.25% 0 0 1ml 0 0 0 双丙酸铵0.25% 0 0 0 1ml 0 0 丙酸钙0.3% 0 0 0 0 1ml 0 双丙酸铵0.3% 0 0 0 0 0 1ml 空白 0 0 0 0 0 0 菌落总数越少，表明其防霉抑菌效果越佳，根据所测的菌数计算出各防霉剂的抑菌率来准确表示防霉效果。 液体培养的抑菌效果 配制液体查氏培养基，采用液体培养基直接培养方法，设计防霉剂样品丙酸钙和双丙酸铵的添加浓度梯度，直接在培养基中加入防霉剂样品，浓度梯度见表一，以不加防霉剂作为空白对照，在每个培养基中添加0.2ml霉菌孢子液，30℃摇床培养16-20小时，观察培养基中的霉菌生长情况。以目测三角瓶中霉菌菌丝体的数量和大小来判断各防霉剂的防霉效果。 表二 液体培养基中添加的防霉剂的量 样品 丙酸钙/g 双丙酸铵/g 空白 0 0 丙酸钙0.5% 0.25 0 丙酸钙0.55% 0.275 0 丙酸钙0.6% 0.3 0 双丙酸铵0.2% 0 0.1 双丙酸铵0.25% 0 0.125 双丙酸铵0.3% 0 0.15 1.3.3 杯碟法检测防霉剂防霉效果 将霉菌孢子液以2%添加到固体培养基中（若实验结果为出现抑菌圈可稀释后重复实验），混合均匀后倒平板。将灭菌后的牛津杯放入琼脂培养基中，每个平板放置三个，并呈三角形对称排布。在三个牛津杯中分别加入200μl 0.6mg/ml的丙酸钙溶液、200μl 0.6mg/ml的双丙酸铵溶液和200μl的无菌水，加入无菌水的杯碟为空白对照。每组设置三个平行30℃培养48个小时，观察牛津杯周围抑菌圈直径大小定量测定其防霉效果。以同样地方法分别用0.5mg/ml 、0.4mg/ml的丙酸钙溶液、双丙酸铵溶液代替0.6mg/ml的丙酸钙和双丙酸铵进行防霉实验。 实验结果分析 2.1平皿抑菌计数法的实验结果 表三平皿中霉菌的菌落数 样品名称 平行1(个/皿) 平行2 (个/皿) 平行3 (个/皿) 平均值(个/皿) 抑菌率 丙酸钙0.2% 36 30 29 31.66 35.38% 双丙酸铵0.2% 12 19 14 15 69.39% 丙酸钙0.25% 24 26 23 24.33 50.35% 双丙酸铵0.25% 8 4 6 6 87.76% 丙酸钙0.3% 18 15 16 16.33 66.67 双丙酸铵0.3% 0 0 0 0 100% 空白 49 50 48 49 0 表三中结果显示随着培养基中丙酸钙、双丙酸铵浓度的增加，霉菌的数量不断减少，抑菌率增大，但在相同浓度下，双丙酸铵对于米曲霉的抑制能力要好于丙酸钙。 2.2 液体培养的抑菌效果的实验结果 图一 不同浓度的丙酸钙添加浓度对霉菌的抑制结果 由图一的实验结果可以看出随着丙酸钙在培养基中的浓度的增加，培养基中霉菌的数量在减少。当丙酸钙在培养基中的浓度达到0.6%时，培养基中已没有霉菌生长，因此丙酸钙对霉菌的最低抑菌浓度为0.6mg/ml。 图二 不同浓度的双丙酸铵对霉菌的抑制结果 由图二的实验结果可以看出随