骨髓间充质干细胞向软骨细胞表型分化的影响因素.doc

骨髓间充质干细胞向软骨细胞表型分化的影响因素 作者：王昌耀 作者单位：青岛大学医学院附属医院关节外科，山东 青岛 266003 【关键词】 骨髓 间充质干细胞 软骨细胞 影响因素 关节软骨在受到创伤后,难以自行修复。传统的治疗方法如软骨下骨钻孔术、软骨移植、骨膜或软骨膜移植、软骨细胞移植等因修复组织以纤维软骨为主,缺少正常透明软骨的力学性能及耐用性,故不能取得满意效果。而应用组织工程方法修复关节软骨缺损却展示了令人鼓舞的前景。种子细胞是组织工程化软骨形成的首要条件。骨髓间充质干细胞(MSCs)是来源于骨髓的一群非造血干细胞,在不同诱导条件下具有向成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞、成纤维细胞、神经细胞分化的潜能。MSCs因具有易于从骨髓中分离和体外大量扩增纯化、供区损伤小、便于自体移植、在适宜的体内或体外条件下可分化形成软骨组织等特点，故被认为是软骨组织工程最有希望的种子细胞来源之一。现就影响MSCs向软骨细胞表型分化的因素综述如下。 1 培养方法 目前，绝大多数实验室采用低糖DMEM培养基进行MSCs的分离与扩增，少数实验应用DMEM/F12、ΑDMEM进行，因为低糖条件比高糖条件更利于MSCs的增殖［1］。传代细胞接种密度多为(3～7)×104/cm2。MSCs向软骨诱导分化多使用高糖DMED培养基，再添加地塞米松、Vit C以及培养基添加物ITS(insulitransferrinsodium selenite media supplement)等构成不完全诱导培养基。实验时再添加有诱导分化作用的细胞因子,如转化生长因子(TGF)、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）等即可构成完全诱导培养基。 为模拟胚胎时期软骨形成的体内环境，越来越多的试验者倾向于应用高密度培养或所谓的微球（pellet）方式来重现胚胎发育过程中的软骨前体状态。目前认为,通过离心处理使MSCs聚集成团,利于细胞间的自分泌与旁分泌,更符合软骨生长的要求。PITTENGER等［2］采用离心沉淀式培养法刺激MSCs向软骨细胞分化。首先通过离心使MSCs细胞形成小的团状沉淀,然后静置培养,10～14 d后,细胞形态由梭形变为肥大软骨细胞状,表达软骨细胞的特异分子标记物Ⅱ型胶原及胞外基质中蛋白聚糖丰富。并且,随着培养时间的推移,具有软骨细胞分子标记物的细胞数量越来越多。培养3个月,通过组织学观察可见软骨细胞样陷凹。 2 细胞因子 诸多试验表明，细胞因子对体外培养的MSCs有着强大的诱导分化能力，其中尤以TGF超家族成员效能最强。 2.1 TGFΒ系列生长因子 TGFΒ系列生长因子(TGFΒ1、Β2、Β3)是一族具有多种功能的多肽,它们能够促进细胞增殖,调节细胞分化,促进细胞合成并分泌细胞外基质。1998年JOHNSTONE等［3］率先在体外诱导成年哺乳类MSCs分化生成软骨获得成功。其培养液的成分为:DMEM液,ITS和Premix(含胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸、亚油酸、牛血清清蛋白、丙酮酸、抗坏血酸磷酸盐),细胞聚集培养时加入TGFΒ1 0.5～10 ng/L。微球细胞团在37 ℃体积分数0.05 CO2环境下培养,7 d时出现Ⅱ型胶原阳性表达,以后逐渐增强，21 d后形成的聚合物完全类似软骨的形态,甲苯胺蓝染色观察证实其具有软骨基质的特征,可检测到Ⅱ型胶原和Ⅹ型胶原mRNA表达,而Ⅰ型胶原不表达,说明MSCs形成的是软骨组织,并且为终末表型的肥大软骨细胞。 WORSTER等［4］在MSCs培养液中加入不同浓度的TGFΒ1,结果表明，经5 ng/L TGFΒ1处理的MSCsⅡ型胶原mRNA含量是对照组的1.7倍,Ⅱ型胶原免疫组化染色区域和强度与TGFΒ1的浓度呈量效增长关系。在进一步的研究中，WORSTER等［5］观察了MSCs在含TGFΒ的单层培养基及含胰岛素样生长因子(IGFⅠ)的三维纤维条件培养基中的软骨发生,结果显示，0或5 ng/L的TGFΒ作用6 d后,置于0或100 ng/L的IGFⅠ的三维纤维条件培养基中,13 d后行Ⅰ、Ⅱ型胶原原位杂交和免疫组化测定蛋白多糖及DNA含量。开始4 d中,TGFΒ作用的MSCs明显增殖,形成细胞集落,蛋白多糖增加2倍;IGFⅠ作用后,包括蛋白多糖和Ⅱ型胶原mRNA等软骨细胞功能指标显著增强;TGFΒ作用后不经IGFⅠ作用的细胞,软骨生成指标表达减弱,提示MSCs的分化尚不完全,但两种因子具有协同作用。 BARRY等［6］进一步研究发现，TGFΒ2和TGFΒ3诱导MSCs向软骨细胞分化的能力