高效表达大肠杆菌目标基因的战略和技术生物技术1101吕飘飘.docVIP

高效表达大肠杆菌目标基因的战略和技术 背景：1980年异源基因表达技术逐渐成为一门科学，相关技术的突破性进展以惊人的速度不断出现。基因表达技术是基因工程的核心技术之一．外源基因在受体细胞中的表达包括转录和翻译两个环节，它是在一系列酶蛋白和调控序列的共同作用下完成的。而大肠杆菌作为优良的受体菌表达载体，其优化策略值得深究。 一、大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征 1.大肠杆菌表达外源基因的优势 全基因组测序，共有4405个开放型阅读框架 基因克隆表达系统成熟完善 繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定 被美国FDA批准为安全的基因工程受体生物 2.大肠杆菌表达外源基因的劣势 缺乏对真核生物蛋白质的复性功能 缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统 内源性蛋白酶降解空间构象不正确的异源蛋白 细胞周质内含有种类繁多的内毒素 二、高效表达目标基因的战略和技术 1.表达质粒的优化和设计 在各种表达载体中，启动子和 SD序列的下游都设计了一段含有各种限制性酶切位点的序列，用于目标基因的插入。这一插入位点附近的序列将成为核糖体结合位点的一部分，因此它对于构建高效表达质粒是至关重要的。 由于每一个基因都具有各自独特的 5’ 端结构，最终构建成的各种表达质粒所具有的核糖体结合位点是一个变量。 构建表达质粒时首先要考虑使目标基因的翻译起始密码 ATG 与 SD 序列之间的距离和碱基组成处于一个适当的范围内。 核糖体结合位点序列的变化对 mRNA 的翻译效率有显著影响，具体表现为： SD 序列 UAAGGAGG 的翻译效率要比 AAGGA 高3～6倍 翻译起始密码 ATG 与 UAAGGAGG的最适距离是 6～8 个碱基长度， 与 AAGAA 的最适距离是5～7 个碱基长度 ATG 与 UAAGGAGG 至少相隔 3 ～ 4个碱基，与 AAGAA 至少相隔 5个碱基； mRNA 的翻译才能进行 ATG 与 SD 序列之间的碱基组成为 A，T 碱基丰富时，mRNA 翻译效率较高。 核糖体结合位点本身和附近的序列决定了目标基因 mRNA 5’ 端的二级结构，研究表明讨 mRNA 5’端形成的 “茎环” 结构阻碍了 mRNA 与核糖体 30S 亚基的结合，从而抑制了翻译的起始。 尽量提高核糖体结合位点本身和附近的序列中 A/T 碱基的含量，降低 mRNA 5’ 端形成的 “茎环” 结构的可能性，也是构建表达质粒时需要注意的事项。 在必要的情况下，还可通过定点突变，PCR 等技术改变个别关键的碱基来破坏 mRNA 5’ 端的 “茎环” 结构 。 把目标基因设计成多顺反子结构，在大肠杆菌本身的高效翻译起始元件后加上第二个 SD 序列和目标基因，一起插入表达载体。这一方法通常适用于目标基因 5’ 端序列容易形成二级结构，而又不宜改变其序列的情形下表达质粒的优化和设计 在构建表达质粒时，充分利用各个基因的结构特征和特点，注意引入翻译增强子序列能提高 mRNA 翻译效率的特殊核苷酸序列，称为翻译增强子 。 共表达大肠杆菌稀有密码子 tRNA 基因 表达水平高的基因呈现的密码子偏爱性高于表达水平低的基因。 现已阐明的在大肠杆菌中的稀有密码子有： 编码 Arg 的密码子 AGA、AGG、CGA、CGG 编码 Pro 的密码子 CCC、CCU、CCA 编码 Cys 的密码子 UGU、UGC; 编码 Gly 的密码子 GGA、GGG 编码 Leu 的密码子 CUA、CUC 编码 Ile 的密码子 AUA 编码 Ser 的密码子 UCA、AUG、UCG、UCC 由于同义密码子的使用频率与细胞内对应的 tRNA 的丰度有正比关系稀有密码子对应的 tRNA 的丰度很低，有可能在翻译过程中发生中止和移码突变。解决这一问题的办法： 通过基因突变把稀有密码子改变为其他使用频率高的同义密码子。 在表达系统中共表达稀有密码子 tRNA 基因，以提高大肠杆菌细胞内稀有密码子 tRNA 的丰度 在所有的大肠杆菌稀有密码子 tRNA 中，tRNA Arg (AGG/AGA) 含量最少，而 AGG 和 AGA 密码子在真核基因中经常出现。 人尿激酶原 ProUK，新型组织纤溶酶原激活剂 NTA 等基因中都含有较多的 AGG 和 AGA 密码子， 在大肠杆菌中直接表达的水平很低，但在大肠杆菌中共表达 tRNA Arg(AGG/AGA) 基因 argU 后， 这些基因的表达水平能明显得到提高。 现在还没有一个固定规则来判定稀有密码子的存在是否确实会对翻译过程产生明显的