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分子生物学实验技术 分子生物学研究 分子生物学研究对象 分子生物学研究技术 实验内容： 核酸的分离纯化、鉴定与分析 基因工程技术基本流程 Contents 2011级硕士生分子生物学实验 核酸的分离制备及分析及在医学研究中的应用 DNA的制备与分析 真核细胞基因组DNA的分离纯化(蛋白酶K法) DNA的紫外定性、定量分析及琼脂糖凝胶电泳鉴定 基因表达水平分析的原理与方法（RNA的分离纯化及分析） 真核组织总RNA提取（TRIzol试剂法） RNA紫外定性、定量分析及甲醛变性琼脂糖凝胶电泳鉴定 目的基因PCR及PCR产物琼脂糖凝胶电泳鉴定 凝胶成像系统的应用（示教） 基因工程技术基本实验 利用感受态细菌（DH5a）进行重组质粒转化、Amp琼脂平板筛选 利用阳性克隆菌（单菌落）进行质粒的小量扩增 质粒DNA提取（碱裂解法） 质粒DNA的限制性内切酶酶切及酶切片段非变性 PAGE鉴定 核酸的分离与纯化 基本原则： 1、保证一级结构的完整性，完整的一级结构是研 究核酸结构和功能的基础； 2、排除蛋白质、脂类、糖类等其他分子的污染。 真核核酸提取的主要步骤 来源：真核生物的一切有核细胞（包括培养细胞） 温和裂解细胞，溶解核酸，使核酸与组蛋白分离； 采用化学或酶学方法去除蛋白质、DNA/RNA及其他大分子。 真核基因组DNA的制备与分析 蛋白酶K－苯酚抽提法分离纯化真核细胞基因组DNA DNA的紫外定性、定量分析及琼脂糖凝胶电泳鉴定 制备基因组DNA是进行基因结构和功能研究的重要步骤。可从新鲜组织、培养细胞或低温保存的组织细胞中提取。常采用EDTA、SDS以及蛋白酶K等试剂作用下破膜、消化细胞，并使组织蛋白与DNA分子分离，再用酚、氯仿/异戊醇抽提去除蛋白质，最后经乙醇沉淀而获得高纯DNA。操作中常加入RNase除去RNA，这一方法获得的DNA可用于Southern分析，还可用于PCR的模板、基因组DNA文库构建等实验。通常可得到100～200kb的DNA片段。（一般真核细胞基因组DNA有107-9bp。） DNA提取应注意 （1）防止和抑制DNase对DNA的降解； （2）尽量减少对溶液中DNA的机械剪切破坏。 操作步骤 1．材料处理新鲜或冰冻组织处理：⑴ 取约50～100mg肝组织, 剪碎，加组织细胞裂解液0.5ml匀浆。⑵ 将匀浆液转至1.5ml Eppendorf管（Ep管）中。(此时于匀 浆液中加入终浓度为20μg/ml的无DNase的RNase A)。⑶ 加5μl蛋白酶K (终浓度100μg/ml)，混匀。⑷ 37℃水浴1h后转为50℃水浴3h（裂解细胞，消化蛋白）， 经常摇动。 操作步骤 2．室温下加500μl饱和酚至样品处理液中，缓慢颠倒混匀10min。 3．离心12000rpm×10min,取上层水相到新Ep管中 (约450μl)。 4．加等体积氯仿/异戊醇（24：1），充分混匀，离心12000rpm×10min，取上层水相(约300μl)到另一Ep管中。 5．加1/10体积的3 mol/L 醋酸钠(pH5.2)和2.5倍体积预冷的无水乙醇，颠倒混匀。 6．离心14000rpm×15min，小心弃上清液。 7．沉淀用70%冷乙醇洗涤1-2次，离心收集沉淀DNA,室温下挥发乙醇(勿使DNA完全干燥)。 8．沉淀DNA加50-100μl TE缓冲液溶解，－20℃保存或直接分析. 标本必须新鲜，提取前细胞应保持完整。所用Ep管、滴头等用品及ddH2O、试剂等应高压灭菌，操作尽量在4℃以下进行。 混匀试剂、吸取上清液等操作时应避免动作剧烈。 弃去乙醇时动作应轻，切忌甩干，以免DNA丢失。 37%以上浓度的异丙醇或者70%以上浓度的乙醇可选择性沉淀DNA，一般不需在低温条件下长时间放置。其缺点是易使盐类与DNA共沉淀；所以常规需要70%乙醇漂洗DNA沉淀物。 室温下放置16h或65℃放置1h，可加快基因组DNA沉淀的溶解。 核酸的鉴定与分析 紫外分光光度法可用于确定核酸的浓度及纯度。 核酸的分级分离。层析技术及凝胶电泳法，凝胶电泳分离法分制备型和分析型，根据分离核酸片段的大小可选择不同参数或条件的琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶电泳。 核酸杂交技术用于鉴别某个特定的片段。 多聚酶链反应（polymerase chain reaction, PCR）对目的基因进行DNA序列分析及鉴定 。 DNA测序 基因表达分析:（RNA详细结构和数量的分析） DNA的鉴定 一、紫外法测DNA的纯度及浓度 原理 组成核酸的嘌呤嘧啶碱基均有紫外吸收特性，最大吸收峰在260nm，这是紫外测定核酸的基础。蛋白质在280n