4基因克隆的载体6.ppt

一、概述 1、载体（vector）的概念： 是由在细胞中能够自主复制的ＤＮＡ分子构成的一种遗传成分，通过实验手段可使其它的ＤＮＡ片段连接在它的上面，而进行复制。 2、作为基因工程的载体，必须具备以下几个性能 （1）分子较小，可携带比较大的ＤＮＡ片段。 （2）能独立于染色体而进行自主复制并且是高效的复制。 （3）要有尽可能多种限制酶的切割位点，但每一种限制酶又要最少的切割位点（多克隆位点，MCS） 。 （4）有适合的标记，易于选择。 （5）有时还要求载体要能启动外源基因进行转录及表达，并且尽可能是高效的表达。 （6）在细胞内稳定性要高，以保证重组体稳定传代而不消失 （7）从安全角度考虑，要求载体不能随便转移，仅限于在某些实验室内特殊菌种内才可复制等等。 报告基因（reporter gene）：载体上引入的一些具有特殊标志意义的基因，可用来证明载体已经进入宿主细胞，并可用来将含有目的基因的宿主细胞从其它细胞中区分甚至挑选出来，这种具有标志意义的基因称为报告基因(标记基因)。 最常用的报告基因有抗药性基因，如抗氨苄青霉素、抗四环素、抗氯霉素、抗卡那霉素或抗新霉素等基因。lacZ基因、cat基因。 蓝白斑筛选的原理 重组质粒转化细菌后，蓝白斑筛选往往是基于抗生素筛选基础上的第二次筛选。 一般培养转化细菌的培养基中都要加入一定浓度的适宜抗生素，只有含有质粒载体的细菌才可以生长形成菌落，即抗生素完成对细菌是否含有质粒载体进行了初步筛选。 质粒载体上存在的LacZ基因片段当被外源DNA片段插入时，会产生白色的克隆，不含插入片段的质粒进入宿主细胞生成蓝色菌落。这就是蓝白斑筛选，即a-互补显色反应 MCS 载体的致死效应 利用质粒或噬菌体载体进行基因克隆时，有时在大量的克隆化基因（这些基因的合成消耗大量宿主细胞的营养和能量）和克隆化基因产物可能又是有害的，例如大量表达的蛋白质不利于宿主菌的生长繁殖，甚至可使宿主菌中毒死亡，即载体导致宿主细胞呈现致死效应。 3、载体的分类 二、质粒（plasmid）克隆载体 质粒是一种独立于染色体外的小分子环状DNA，一般大小约106~108D，可自身复制和表达，有的质粒还带有可做为选择性标记的抗药性基因，所以质粒经过适当改选后便可成为良好的载体。 作为载体的质粒大多是由天然质粒经人工适当改造而成的，目前已有多种经改造的良好的质粒载体。 质粒的类型 F质粒 F因子 能够使寄主染色体上的基因和F质粒一道转移到原先不存在该质粒的细胞中 R质粒 抗药性因子 编码一种或数种抗菌素抗性基因，并且通常能够将这种抗性转移到缺乏该质粒的适宜受体细胞，使后者也获得同样的抗菌素抗性能力 Col质粒 能够产生大肠杆菌素因子，有控制大肠杆菌素合成的基因。大肠杆菌素是一类可以使不带有Col质粒的亲缘关系比较密切的细菌菌株致死的蛋白质。 接合型质粒 F，F’，Col，R 非接合型的质粒 Col ，R (２)分子大小： 100～102 kb 复制强度：拷贝数（细胞内质粒与染色体数量之比值） （１）每种质粒在其宿主细胞内的拷贝数相对稳定 严紧控制型：1~数个拷贝；大质粒 松驰控制型：10个以上拷贝；小质粒。 经氯霉素处理，宿主中质粒大量扩增（如ColE1拷贝数达3000个）。 (４)质粒的不亲合性 亲和性质粒：能在同一细胞中复制的几种质粒 不亲和性（不相容性）质粒：不能在同一细胞中复制的质粒 意义：宿主细胞内的原有质粒与克隆载体的质粒必须是亲和性质粒，最好不含内源性质粒 (５)质粒迁移 ①接合质粒： 含tra基因→合成细胞表面物质（鞭毛）→质粒DNA入受体细胞 含tra基因的质粒称为接合质粒。如F、Ti等 不含tra基因的质粒称为非接合质粒。如ColE1、pPbS等 ②迁移作用 不含tra基因而含bom（oriＴ）位点的质粒，当宿主细胞存在辅助质粒mob基因产物时，即可打开oriＴ位点，非结合质粒借助接合质粒tra基因的产物而迁移入受体细胞。这种现象称～ (６)显性质粒和隐蔽质粒 宿主因含某种质粒而呈现出新的性状，称为显性（表达型）质粒。 显性质粒 Ｒ质粒：含有氨苄青霉素Ap、氯霉素Cm、卡那霉素Km、四环素Tc、链霉素Sm等药物的抗性基因，可作为选择标记。 Col质粒 Ｆ质粒 隐蔽质粒 蓝藻内源质粒 3、质粒载体必须具备的基本条件 (1) 具有复制起点：自我增殖的基本条件，一般具一个复制子； (2) 具有抗菌素抗性：理想的质粒载体具有两种抗菌素抗性基因； (3) 具有若干限制酶切单一位点（MCS）； (4) 具有较小的分子量和较高的拷贝数； 低分子量的质粒易于操作，克隆外源片断后仍能有效的转化