DNA的Feulgen染色法.ppt

DNA的Feulgen染色和细胞有丝分裂相的观察 DNA是主要的遗传物质，主要分布在核的染色质或有丝分裂过程中出现的染色体内。自从1924年Feulgen等人建立了DNA-Feulgen染色方法以来,至今这种方法仍是DNA定量测定的主要染色方法之一。 一、实验目的 1 了解Feulgen反应的基本原理。 2 熟悉传统细胞化学实验的基本实验技能和操作方法。 3 掌握细胞分裂各期的主要特点。  二、实验原理 DNA经弱酸（1mol/LHCL）水解，其上的嘌呤碱和脱氧核糖之间的键打开，使脱氧核糖的一端形成游离的醛基，这些醛基在原位与Schiff试剂（无色品红亚硫酸溶液）反应，形成紫红色的化合物，使细胞内含有DNA的部位呈紫红色阳性反应。 紫红色的产生，是由于反应产物的分子内含有醌基，醌基是一个发色团，所以具有颜色。对照组预先用热三氯醋酸或DNA酶处理，抽提去细胞中的DNA而得到阴性反应，从而证明了Feulgen反应的专一性。 三、试剂 1. Carnoy固定液 ：3份95%酒精加入1份冰醋酸。 2. 1mol/LHCL ：准确量取86.2ml浓盐酸（比重1.18）加入到93.8ml蒸馏水中。 3. Schiff试剂：称1g碱性品红于200ml煮沸的重蒸馏水中，5分钟后断电使其冷却至55～50℃，过滤到一个棕色的试剂瓶中，加入1N?HCl??20ml，继续冷却至25℃，加入1g偏亚硫酸氢钠，摇动瓶子使其溶解。密闭瓶口，置黑暗低温处或冰箱内（4℃左右），18～24小时后检查，试剂如透明无色或呈浅黄色时即可使用，这就是Schiff试剂溶液。如有不同程度的红色未褪，可加入1g活性炭，强烈震荡一分钟，仍在低温下静置过夜，然后用滤纸过滤后使用。密封瓶口，包以黑纸，在5℃以下冰箱内可以保存半年。 4. 亚硫酸水溶液 (漂白液)：在200ml蒸馏水中，加入10ml?1N?HCl?和10ml??10%偏亚硫酸氢钠水溶液（或1.0g固体）。此液在临用前配制。 否则会因SO2的的逸出而失效。 5. 5%三氯乙酸 6. 0.5%固绿酒精溶液（95%的酒精溶解） 四、实验材料及实验器材 1. 材料 Carnoy液固定的洋葱根尖 2. 实验器材 显微镜、恒温水浴锅、镊子、解剖针、剪刀、载玻片、盖玻片、吸水纸、青霉素瓶、吸管、烧杯、量筒。 五、实验方法和步骤 （一）材料准备??取洋葱头若干，剥皮后置于盛有水的培养皿内使其长出新根。待根尖长1cm时，剪下根尖固定在Carnoy固定液内、保存备用。 （二）水解??实验时，取出预先准备好的洋葱根尖，用自来水漂洗后，置于3ml 1mol/L?HCl中，在60±0.5℃恒温水浴锅中水解8-15分钟。然后吸去热1mol/L HCl，再用自来水将根尖洗3次。 水解是本实验成败的关键之一。重要的是温度，应保持在60±0.5℃之间。如果温度过高或时间过长，造成水解过度，醣与醛基之间的键被破坏，醛基流失到水解液中；反之，不能出现潜在的醛基，都不能呈现颜色反应。 预处理：切取长约5mm的植物根尖，加入Carnoy固定液固定2小时以上。样品可以转入70%酒精中长期保存。 将根尖放入1mol/L的盐酸中，60℃水浴，恒温条件下解离8~15min。 （三）染色??吸净水分，加入Schiff试剂避光染色40min~60min，用亚硫酸水漂洗2～3次，每次5min，然后经自来水流水冲洗干净后准备压片。 （四）压片法??取一根尖置于载玻片上，用切下生长区部位（染成紫红色），加盖玻片，用拇指或铅笔的橡皮头轻压使细胞分散均匀，镜检。 （五）对照组预先用5%三氯醋酸（90℃）处理15min，然后再依次进行实验步骤（二） （三） （四）。 染色后倒出Schiff试剂，亚硫酸水漂洗2～3次，每次3~5min，自来水漂洗干净，盖上盖玻片。 用镊子或铅笔轻轻敲打，使根尖细胞分散开。 六、有丝分裂各期观察 洋葱根尖压片的观察 首先在低倍镜下，区分根尖的分生组织区及延长组织区的细胞，然后，在高倍镜下，观察细胞核的形态，注意在你的片子上，是否有有丝分裂细胞，如有，你能找到细胞分裂期的几个阶段，其特征如何？（可参照附录） 实验结果 附录：植物细胞分裂的几个时期。 细胞周期分为间期及分裂期，按照有无核膜，核仁、染色体，以及染色体形态与分布位置的变化，细胞有丝分裂又分为前期、中期、后期和末期四个阶段。现将各期特点简述如下， （1）前期：此期的染色质螺旋盘绕成一定数目的细而长的染色丝，此即染色体。染色体先是分散于核液中，以后，逐渐向核膜移动，在此时，核仁逐渐消失，核膜溶解。 （2）中期：染色体进一步盘绕，变短变粗，在细胞的中央（即赤道板）规则地排列成行，仔细观察，可看