蛋白质的理化性质与分离分析更新版.pptVIP

蛋白质的理化性质、测定及分离纯化 蛋白质的理化性质 蛋白质的理化性质 蛋白质溶液是一种胶体溶液； 特定的空间构象，分子量一定?分子筛层析； 在大部分pH条件下，蛋白质分子同时存在两种电荷?等电点沉淀，盐溶，盐析，电泳，离子交换层析等； 一般而言，蛋白质分子上同时存在疏水和亲水区域?有机溶剂沉淀，疏水层析(反相层析)； 蛋白质的胶体性质 蛋白质分子量大，介于一万到百万之间，故其分子的大小已达到胶粒1-100 nm范围之内。球状蛋白质的表面多亲水基团，具有强烈吸引水分子的作用，使蛋白质分子表面常为多层水分子所包围--水化膜，从而阻止蛋白质颗粒的相互聚集。 与低分子物质相比，蛋白质分子扩散速度慢，不易透过半透膜，粘度大，在分离提纯蛋白质过程中，可以利用蛋白质的这一性质，将混有小分子杂质的蛋白质溶液置于半透膜制成的透析袋或管内，浮于流动动水或适宜的缓冲液中，小分子杂质皆易从袋中透出，保留了比较纯化的蛋白质，即透析(dialysis)。 蛋白质分子上的电荷与疏水区 蛋白质的两性电离和等电点 蛋白质是由氨基酸组成的，分子中除两端的游离氨基和羧基外，侧链中尚有一些解离基，如Glu、Asp残基中的γ和β-羧基，Lys残基中的ε-氨基，Arg残基的胍基和His的咪唑基。作为带电颗粒，可以在电场中移动，移动方向取决于蛋白质分子所带的电荷性质。蛋白质颗粒在溶液中所带的电荷，既取决于其分子组成中碱性和酸性氨基酸的含量，又受所处溶液的pH影响。当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质游离成正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子(zwitterion，净电荷为0)，此时溶液的pH值称为蛋白质的等电点(isoelectric point，pI)。处于等电点的蛋白质颗粒，在电场中并不移动。蛋白质溶液的pH大于等电点，该蛋白质颗粒带负电荷，反之则带正电荷。 溶液中的蛋白质颗粒 pH=pI时，蛋白质分子所带净电荷为零，蛋白质分子在电场中不移动。 pH＞pI时，蛋白质分子所带净电荷为负，蛋白质分子在电场中向阳极移动。 pH＜pI时，蛋白质分子所带净电荷为正，蛋白质分子在电场中向阴极移动。 在pI时，蛋白质失去了胶体的稳定条件，即没有相同电荷相互排斥的作用，所以不稳定，溶解度最小，易沉淀。 蛋白质在等电点时的溶解度最小 蛋白质的变性(Denaturation) 天然蛋白质的严密结构在某些物理或化学因素作用下，其特定的空间结构被破坏，从而导致理化性质改变和生物学活性的丧失，如酶失去催化活力，激素丧失活性--蛋白质的变性作用(denaturation)。变性蛋白质只是空间构象的破坏，一般认为蛋白质变性的本质是次级键，二硫键的破坏，并不涉及一级结构的变化。 变性蛋白质和天然蛋白质最明显的区别是溶解度降低，同时蛋白质的粘度增加，结晶性破坏，生物学活性丧失，易被蛋白酶分解。 引起蛋白质变性的因素 引起蛋白质变性的原因可分为物理和化学因素两类。物理因素可以是加热、加压、脱水、搅拌、振荡、紫外线照射、超声波的作用等；化学因素有强酸、强碱、尿素、重金属盐、十二烷基磺酸钠(SDS)等。在临床医学上，变性因素常被应用于消毒及灭菌。反之，注意防止蛋白质变性就能有效地保存蛋白质制剂。 变性与复性 变性并非是不可逆的变化，当变性程度较轻时，去除变性因素，有的蛋白质仍能恢复或部分恢复其原来的构象及功能，变性的可逆变化称为复性(renaturation)。例如，核糖核酸酶中四对二硫键及其氢键，在β—巯基乙醇和8 M尿素作用下，发生变性，失去生物学活性，变性后如经过透析去除尿素，β—巯基乙醇，并设法使疏基氧化成二硫键，酶蛋白又可恢复其原来的构象，生物学活性也几乎全部恢复，此称变性核糖核酸酶的复性。 许多蛋白质变性时被破坏严重，不能恢复，称为不可逆性变性。 蛋白质的盐溶和盐析 蛋白质的沉淀 (Precipitation) 蛋白质分子凝聚从溶液中析出的现象-蛋白质沉淀，变性蛋白质一般易于沉淀，但也可不变性而使蛋白质沉淀，在一定条件下，变性的蛋白质也可不发生沉淀。 蛋白质所形成的亲水胶体颗粒具有两种稳定因素，即颗粒表面的水化层和电荷。若无外加条件，不致互相凝集。然而除掉这两个稳定因素(如调节溶液pH至pI和加入脱水剂)，蛋白质便容易凝集析出。但如将溶液pH调节到蛋白质pI，蛋白质分子呈等电状态，虽然分子间同性电荷相互排斥作用消失了。但是还有水化膜起保护作用，一般不致于发生凝聚作用，如果这时再加入某种脱水剂，除去蛋白质分子的水化膜，则蛋白质分子就会互相凝聚而析出沉淀；反之，若先使蛋白质脱水，然后再调节pH到等电点，也同样可使蛋白质沉淀析出。 盐 析 (Salting Out) 在蛋白质溶液中加入大量的中性盐以破坏蛋白质胶体的稳定性而使其析出，这