传代细胞培养实验.pptVIP

传代细胞培养实验 费晓方 掌握无菌操作技术。 了解传代细胞的培养的一般方法与步骤。 了解培养细胞的消化分散。 了解细胞计数方法。 了解培养液配制方法。 了解倒置显微镜的使用。 实验原理： 细胞培养是将机体内的某组织取出，分散成单细胞，在人工条件下培养使其生存并不断生长、繁殖的方法。借助这种方法可以观察细胞的分裂繁殖、细胞的接触抑制、以及细胞的衰老，死亡等生命现象。还可以利用培养细胞制备染色体，分析外界因素（如理化因素）对细胞的影响，研究细胞癌变等等。在细胞培养的基础上发展了细胞融合、细胞杂交等细胞工程技术及单克隆抗体技术。 实验内容： * 早期细胞培养，依靠的是精湛的操作技术和尽可能的靠近火焰一达到细胞的无菌化。 * 目前，超净台是使工作台无菌化最经济有效的手段。 （1）超净台的选择，应选择层流超净台。不能选择平流超净台。超净台应该尽可能的安装紫外灯。 （2）超净台的维护，超净台的HEPA过滤层应该每一年或一年后由认可的机构进行维修。 2.细胞培养所用玻璃及塑料制品的处理 用于细胞培养的器材包括：细胞培养瓶，细胞培养板，吸管，各种瓶子等。 目前，上述器材均可以从商家买到无菌一次性的用品。但是，成本太高。 玻璃器材，经过湿热或者干热灭菌后可以反复使用。 不宜进行高温高压灭菌的器材，可以浸泡在70%乙醇中进行消毒，并在超净台上吹干。 3.实验者的操作技术 无菌操作的原则：保证细胞培养板，细胞培养皿，细胞培养瓶内部以及吸管包裹层等内部的无菌状态。 细胞培养应在超净工作台或有空气滤过装置的工作间里进行。 培养液或其它溶液不应该在工作区以外打开。 装吸管或吸头的容器也不应该在工作区以外打开。 细胞培养中液体的吸取，均需机械移液装置移取。切勿采用口吸的方法。口吸是最大的微生物污染源，更重要的是细胞培养液及成分通过食入或吸入的方式及入人体，可能对研究人员造成伤害。 细胞培养瓶在超净台中打开后，瓶盖应盖顶超下放置与工作台中。 4.细胞的处理以及维持细胞生长所需培养液的无菌处理。 基本培养液由必须氨基酸、维生素、无机盐、葡萄糖和作为生长因子、激素和贴壁因子来源的血清组成。一般用碳酸氢钠（NaHCO3)体系进行缓冲。 细胞的生长不仅产生CO2，也需要CO2才能生存。所以，细胞的培养需要子在CO2培养箱中 CO2培养箱中CO2的浓度应与培养液中碳酸氢钠平衡。如果CO2的浓度为5%，则配培养液中应加入1.97g/L的碳酸氢钠。 培养瓶盖应轻轻的拧上，不要完全拧死，以保证气体的交换。 培养液的pH值应为7.2至7.4。 培养液的pH值应为7.2至7.4。 高密度细胞使细胞培养液中葡萄糖耗竭并产生CO2和乳酸，在含酚红作为指示的培养液中，培养液将从红色变为橙色。细胞培养液长时间贮藏在4°C冰箱中，会使培养液的pH值产生变化，变碱，是培养液的颜色呈深品红紫色。应用时可用Hepes（N-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸）调整。 可以向培养液中加入抗生素，比如青霉素，链霉素，庆大霉素等，抑制由于操作中的微小失误而导致的低水平的感染。但是，有时由于抗生素的加入，也会使感染不易被迅速发现。 培养液的配制： 商家一般以三种形式提供培养液：1.粉末剂 （需要实验着配制）2.浓缩装（用无菌水稀释即可）3.无需进一步处理的工作液形式。由于粉末剂是其中最便宜的一种，一般实验室较多采用。 配制培养液需要滤菌装置：除菌器、真空泵以及0.45μm或0.22 μm的滤膜。 培养液应贮藏在4°C冰箱中。 配好的培养液应在无抗菌素的无菌条件下进行培养，每次配好后留样，培养72小时，观察培养液确实没有污染后使用。 学习传代细胞的培养技术 本次试验应用HeLa细胞或A375-S2细胞进行传代培养。 HeLa 细胞：人子宫颈癌细胞株 A375-S2细胞：人黑色素瘤细胞株 操作前的准备（超净台内物品摆放） 实验材料： 每组的超净台中有以下物品： 1. 50mlRPMI1640培养液1瓶；5ml小牛血清（FCS) 1瓶；2ml胰蛋白酶 1瓶；1ml谷氨酰胺 1瓶；1ml Hepes 1瓶；PBS(-)1 瓶 2. 灭菌1ml移液管 1支；装有试管的灭菌小饭盒 1个；试管架1个；1ml ，200μl移液器各1支；枪头盒2个；细胞计数板1块； 镊子1把，小烧杯1个；酒精灯1台； 培养好细胞的细胞培养瓶1个 操作前准备（酒精灯） 试验操作步骤： 1.从培养箱中取出细胞。在显微镜下观察细胞形态。 2.倒掉原有的细胞培养液，加入5mlPBS(-)洗涤2次。3.加入胰蛋白酶100-200μl，迅速前后旋转细胞培养瓶4-5次，以便胰蛋白酶包被所有细胞，于37°C 培养箱中孵育5分钟，消化细胞 消化细胞时的注意事项  4.在显微镜下观察，细胞变化。待到细胞变为球形