免疫组化操作方法简介.pptVIP

免疫组化基本操作 小 新 免疫组化实验基本原理 免疫组化实验操作步骤 * * SP原理 切片脱蜡至蒸馏水或PBS PBS冲洗2min×3次，（如需抗原修复，可在此步后进） 3%H2O2室温孵育10分钟。蒸馏水冲洗，PBS冲洗2min×3 滴加一抗工作液，37℃孵育1.5~2h或4℃过夜。PBS冲洗， 2min×3次 滴加适当量的检测系统，37℃孵育15－30分钟 PBS冲洗， 2min×3次 DAB显色剂显色 自来水充分冲洗，苏木素复染，脱水透明（如需要）、封 片 组织的前期处理 组织固定 烤片 固定时间对染色的影响 固定比较：Vimentin （V-9） 中性福尔马林固定 72小时 中性福尔马林固定48小时 固定时间较长的标本，可通过加强修复 增强染色效果 取材后组织（1.0×1.4×0.4cm）推 荐后固定时间4-18小时 Ki67 MIB1 Tonsil Fix. 4 h. Tonsil Fix. 168 h. HIER: pH time Ci pH 6 10Min Ci pH 6 30Min TE pH 9 10Min 烤片的温度不宜过高 烤片的时间不宜过长 烤片的影响因素 二个主要因素： 烤片的温度和时间对组织内抗原 的保存有一定的影响，尤其是细 胞核阳性的抗原 推荐烤片温度及时间68-70℃烤2-4 小时 烤片的影响因素 抗原方式的选择及操作方法 一抗的选择及稀释比 检测系统的恰当匹配 实验中需要注意的问题 关键步骤： 温度和时间的相关性 修复液的pH值亦很重要 抗原修复的主要方法 抗原热修复的主要影响因素： 抗原热修复温度和时间的关系 ++ - - 10小时 + - ++++ - 5×10 - +++ ++++ 5× 6 - - +++ 5× 2 60°C 80°C 100°C 时 间 (分钟) MBI单克隆抗体免疫组化灵敏度实验 抗原热修复的有效性 =加热温度（T）× 加热时间（t） 高温可以缩短修复时间 低温需要更长的修复时间 某些蛋白（抗原）需要较低温度修复 微波炉修复和高压锅修复的比较 不均匀 15~20分钟 1P 100°C 微波炉 均 匀 喷气2分钟 1.2P 120°C 高压锅 受 热 时 间 压 力 温 度 不同修复方式CD20的染色结果 单克隆抗体 CD20 高压锅修复 单克隆抗体 CD20 微波修复 抗原热修复:pH值的影响 pH6 A：CD20 B：Ki-67 C：HMB45 D: MOC31 pH8-9 A 稳定型抗体：pH值改变对实验结 果影响不大 B “V”型抗体：强酸强碱修复液效 果好，但强酸条件下，细胞皱缩 变形，影响观察 C 上升型抗体：修复液pH值越高， 效果越好 D　下降型抗体：适用于酸性修复液 四种类型的抗体 抗 原 修 复 Calponin: 用不同pH值修复液的实验结果 高压修复： 将修复液烧开后将切片放入高压锅中，然后 盖好盖子，加上气压阀，继续加热。待喷汽后开始计时2.5分钟后停止加热，自然冷却。 微波修复： 将切片放入修复液中，然后将修复液烧开，此时降低火力持续20分钟。然后自然冷却。 抗原热修复方式的推荐 不修复 热修复 ：微波、高压、水浴 酶消化：胃酶、胰酶、蛋白酶K、 XXV酶 双暴露：先热处理后酶消化or先酶 消化后热处理 选择最佳修复方式 正确的克隆号 适当的稀释度 推荐4℃过夜，可以选择室温1.5－2h或37 ℃1h 一抗的选择 检测系统的选择 针对不同的组织选择不同的二抗 两步法原理 单克隆抗体 Chromogranin A 多克隆抗体 Chromogranin A CgA多克隆与兔单抗比较 针对不同组织选择不同的二抗 对于肝脏、肾脏等生物素含量高的标 本一定要选择非生物素的检测系统 酶标二抗可以有效避免生物素的干 扰并提高敏感性 内源性生物素 Polymer原理图 PV-6000 Polymer原理图 PV-9000 Ki-67 CK *