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分子生物学常用技术(1
生物素标记的核苷酸是最广泛使用的一种,如生物素-11-dUTP,可用缺口平移或末端加尾标记法。实验发现生物素可共价连接在嘧啶环的C5位上,修饰后的dUTP或UTP可替代dTTP参入到标记的探针中。 将地高辛通过一手臂连接至dTTP或dUTP上,生成地高辛配基(Dig-?dTTP或dUTP),再用随机引物法将地高辛配基掺入DNA制成探针。然后用抗地高辛抗体与碱性磷酸酶的复合物和硝基蓝四唑(NBT) ?–?溴氯羟吲哚磷酸盐(BCIP)底物显紫色,灵敏度达0.1pg?DNA。HRP可以邻联茴香胺显棕色。 (十)递减PCR(touch down PCR) 采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳,被检测物是蛋白质,“探针”是抗体,“显色”用标记的二抗。 经过PAGE分离的蛋白质样品,转移到固相载体上。 以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原,与对应的抗体起免疫反应。 再与酶或同位素标记的第二抗体起反应,经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白的表达水平。 * 第四节 生物芯片技术 1.基因检测分析 2.基因表达谱分析 * 一、基因沉默 基因沉默(gene silencing):由各种原因引起的生物体内特定基因不表达。 包括外源基因的转基因沉默和内源基因与外源基因的共抑制现象。 第五节 基因沉默、RNA干扰与基因剔除 * 基因沉默分为三类: (1)位置效应(position?effect):指基因在基因组中的位置对其表达的影响。 外源基因进入受体细胞核后首先整合到染色质上,其整合位点与表达有密切的关系。 (2) 转录水平的基因沉默(transcriptional?gene?silencing,TGS): 在DNA水平上基因表达调控的结果. 主要是由启动子甲基化或导入基因异染色质化,使基因不能正常转录成相应的RNA (3)转录后水平的基因沉默(post-transcriptional?gene?silencing,PTGS): 在RNA水平基因表达调控的结果,比转录水平的基因沉默更普遍. 特点:外源基因能够转录成mRNA,但mRNA一经合成就被降解或被相应的反义RNA或蛋白质封闭,失去翻译的模板作用. 通常是外源基因和内源基因一起沉默,也称为共抑制现象。 * 使基因沉默的常用分子生物学技术: (一)反义核酸技术 (二)三链核酸技术 (三)核酶 (四)RNA干扰技术 (五)基因剔除技术 * (一)反义核酸技术 反义RNA: 与靶mRNA 序列互补的寡RNA 反义DNA:与靶mRNA序列互补的寡DNA 反义核酸 * 反义核酸使基因沉默的可能机制: ①与mRNA前体结合,影响mRNA的加工,阻挡成熟mRNA向细胞质的输送 ②与mRNA结合成双链,阻断核糖核蛋白体同mRNA的结合 ③与mRNA结合形成双链,使mRNA更易被细胞内的核酸酶H(RNase H)识别和降解 ④反义DNA与靶DNA形成三链核酸,对基因转录进行调控 * (二)三链核酸技术 三链核酸技术是利用15~17个核苷酸的短寡聚DNA链,特异地结合到DNA双螺旋的互补区,形成三链核酸,抑制DNA 的转录。 * (三)核酶和脱氧核酶 核酶 (ribozyme): 具有自我剪切和催化功能的RNA分子,它能催化共价键的断裂,通常情况下使靶RNA 降解。 活性结构形式:锤头型、发夹型及斧头型 天然核酶都是单一的RNA分子 人工设计的核酶可由两条RNA链组成。 四、PCR循环参数 变性温度和时间 模板DNA和PCR产物须完全变性(成单链,引物才能在退火过程中与模板结合。) 通过加热实现变性。在90~95℃,DNA分子都会变性。按模板DNA的复杂程度(如G+C含量、模板DNA分子大小),可调整变性温度和时间。温度过高和时间过长,对PCR反应不利。 退火温度和时间 退火温度对PCR反应的特异性有重要影响。合适的退火温度应低于引物Tm值5℃左右。 退火温度过低,引起非特异性扩增产物增多;退火温度过高,PCR扩增产量下降。在允许范围内,选择退火温度的原则:在保证产量的前提下,尽量提高退火温度。 退火时间一般选择30 s~1 min, 足以使模板与引物完全结合。 延伸温度和时间 延伸温度一般为72℃左右。 延伸时间需根据待扩增片断的长短作适当调整。 2kb以内的扩增片断,延伸1 min即可。延伸时间过长易发生非特异性扩增。 循环次数 理论上,20~25次循环后,PCR产物的积累即可达到最大值。 实际操作中,可以35个cycle. * 30个循环
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